Studio Locomotion quantitativa di Liberamente Nuoto microorganismi Uso diffrazione laser

L'obiettivo generale di questa procedura è misurare le frequenze di movimento convulsivo di organismi microscopici in libera nuotata. Questo risultato si ottiene innanzitutto preparando un campione di vermi microscopici. Successivamente, si prepara l'allestimento ottico.

Quindi viene registrato il modello di diffrazione prodotto dagli organismi vivi. Infine, i dati registrati vengono analizzati per determinare le frequenze di nuoto. In ultima analisi, l'analisi della diffrazione viene utilizzata per mostrare i cambiamenti nei modelli di locomozione dei vermi non vincolati.

Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come la microscopia tradizionale, è che i modelli di nuoto possono essere osservati mentre la specie si muove liberamente in uno spazio tridimensionale. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sul nuoto libero di C. elegans, può essere applicato anche ad altri organismi trasparenti, piccoli e microscopici esposti a condizioni variabili. Per preparare C. elegans per l'analisi video, iniziare utilizzando un bastoncino di platino appiattito per trasferire da 10 a 20 nematodi adulti GR su un terreno NGM fresco.

Piastre di Petri contenenti agar con piccole macchie circolari di e coli. Lasciare che i nematodi depongano le uova per tre-cinque ore, quindi rimuovere gli adulti. In questo modo si stabilisce una piccola coltura di 50-150 nematodi con sviluppo sincronizzato, da far crescere fino alla giovane età adulta, incubando le piastre di Petri a 20 gradi Celsius per quattro-cinque giorni.

Nel giorno dell'analisi video, utilizzare un millilitro di acqua deionizzata distillata per lavare una piastra di nematodi adulti giovani, raccogliendo così da 50 a 150 vermi dalla coltura sincronizzata. Utilizzare una microcentrifuga per far sedimentare i vermi sul fondo del tubo oppure lasciarli depositare per gravità per circa 15 minuti. Rimuovere la maggior parte dell'acqua dal tubo e sostituirla con un millilitro di acqua deionizzata distillata per eliminare eventuali batteri aderenti ai nematodi.

Utilizzando una pipetta microlitrica, trasferire da cinque a dieci nematodi in acqua in un vete di quarzo. Assemblare il sistema ottico come mostrato qui, usando un laser all'elio-neon di 543 nanometri per il sovracampionamento, due specchi in alluminio a superficie frontale utilizzati per indirizzare il fascio laser attraverso il vete, un supporto per vete, uno schermo di proiezione e una telecamera ad alta velocità in grado di filmare a circa 240 fotogrammi al secondo. Successivamente, utilizzare un pezzo di paraform per coprire la parte superiore del vete e capovolgerlo per mescolare i nematodi nella colonna d'acqua.

Posizionare il vete in un supporto per vete in modo che i vermi siano inizialmente vicino alla sommità del vete. Utilizzando gli specchi, indirizzare il fascio laser attraverso il centro del vete. Poiché i nematodi sono più densi dell'acqua, scenderanno lentamente verso il fondo del vete mentre nuotano all'interno della colonna d'acqua; sullo schermo di proiezione, colorare di nero la zona corrispondente al fascio laser trasmesso per ridurre la diffusione quando il fascio trasmesso colpisce lo schermo di proiezione.

Eliminare o ridurre la dispersione del fascio trasmesso eviterà che l'array CCD della fotocamera vada in saturazione a causa del fascio trasmesso. Per acquisire una misura delle dimensioni del pattern di diffrazione, tracciare una linea di circa cinque centimetri sullo schermo di proiezione accanto al punto del fascio laser trasmesso, senza interferire con l'immagine della luce diffratta. Spegnere la luce della stanza e registrare le immagini di diffrazione sullo schermo mentre i vermi attraversano il fascio laser.

Per preparare i dati video, installare il seguente programma di analisi video e importare il video nel programma. Impostare l'origine in corrispondenza del punto laser trasmesso utilizzando il software. Tracciare lo spostamento angolare dell'immagine di diffrazione formata da ciascun nematode.

Copiare e incollare i dati in un foglio elettronico e aggiungere 180 gradi o PI per tutti gli angoli negativi, al fine di ottenere un grafico continuo. Utilizzando la configurazione per l'analisi video, posizionare un fotodiodo con una piccola area decentrata nel pattern di diffrazione direttamente davanti allo schermo di proiezione tramite una porta USB.

Collegare il fotodiodo all'oscilloscopio digitale connesso al computer. Osservare i modelli di movimento irregolare sullo schermo del computer. Salvare i set di dati in formato ASCI o testo per analizzare i dati.

Utilizzare il video o la foto per importare i dati in un programma di analisi capace di adattare forme d'onda. Mediante l'adattamento con minimizzazione del chi-quadro, interpolare una curva sinusoidale per determinare la frequenza di dimenamento. Calcolare la media delle frequenze di nuoto provenienti da diversi campioni e determinare la varianza.

Per questo studio, i dati sono stati analizzati statisticamente utilizzando un fattore singolo Inova, seguito dal test di Bon Ferran. Il test di confronti multipli considera un valore di P inferiore a 0,05 statisticamente significativo per modellare i pattern di diffrazione. Iniziare utilizzando un microscopio per acquisire immagini al fine di analizzare un'immagine.

Trascinarlo in Mathematica. Utilizzare il comando "binary eyes" per convertirlo in bianco e nero. In alternativa, utilizzare il comando "edge detect" per creare un'immagine in bianco e nero in cui i due numeri finali controllano la granulosità dei bordi risultanti.

Successivamente, utilizzando il comando image data, convertire l'immagine in una matrice di zeri e uni. Usare il comando forer per trasformare la matrice, quindi elevare al quadrato il valore assoluto della matrice e visualizzare l'immagine risultante, che corrisponde al pattern di diffrazione dell'immagine originale. Inoltre, utilizzare la funzione log per scalare il contrasto dell'immagine.

Infine, confrontare i modelli di diffrazione con i modelli ottenuti da vermi in nuoto libero. In questo esempio, sono stati studiati degli *Caenorhabditis elegans* in una cella di quarzo Q larga un centimetro, spessa cinque millimetri e alta quattro centimetri, campionando un singolo verme mediante analisi video.

La frequenza media del nuoto ottenuta dall'analisi video in un vetrino spesso cinque millimetri era di circa 2,5 hertz. Analogamente, il campionamento di un singolo verme mediante il metodo di acquisizione dati in tempo reale e un oscilloscopio digitale ha prodotto una frequenza di nuoto di circa 2,7 hertz. Questa procedura può essere ripetuta per molti vermi.

Uno studio dettagliato di vermi che nuotano liberamente ha rivelato una frequenza media di nuoto di 2,37 hertz in un vete di cinque millimetri. Come previsto, la frequenza di nuoto è più elevata rispetto a quella di un verme strisciante. Utilizzando questo metodo di diffrazione, si è scoperto che la frequenza media di nuoto di un *Caenorhabditis elegans*, confinato su un vetrino per microscopio, corrisponde al valore precedentemente pubblicato di due hertz.

Dopo il video. La preparazione dei dati e la modellizzazione dei modelli di diffrazione mostrati in questo video permettono di modellizzare i modelli di diffrazione durante il nuoto. Con l'aiuto di immagini di vermi ottenute mediante un microscopio convenzionale, i modelli di diffrazione modellizzati vengono utilizzati per simulare un ciclo di nuoto di *Caenorhabditis elegans*.

Un modello di successo consiste in schemi di nuoto fisicamente realizzabili, che corrispondano alle frequenze di nuoto. Il verme deve avere la stessa forma alla fine del ciclo di nuoto rispetto all'inizio del ciclo di nuoto. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in meno di un minuto per ciascun verme utilizzando la dieta fotografica rapida, osservando i cicli di nuoto sullo schermo del computer.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come valutare nematodi in libera nuotata.