Valutare Miogenica risposta e Vasoactivity nelle arterie di resistenza mesenteriche Utilizzando Myography Pressione

L'obiettivo generale di questa procedura è determinare l'effetto di un agente farmacologico o di uno stato patologico sul tono vascolare indotto dalla pressione nelle arterie mesenterie di piccola resistenza. Ciò si ottiene isolando prima l'arcata mesenterica da un modello murino. Il secondo passo consiste nel sezionare le piccole arterie di resistenza del quarto ordine.

I passaggi successivi sono l'incannulamento, la pressurizzazione e l'incubazione del preparato arterioso. Nella PSS, il passo finale consiste nel valutare l'integrità fisiologica del preparato arterioso, che è dimostrata dallo sviluppo spontaneo del tono vascolare e da un'appropriata risposta reversibile a un vasocostrittore e a un vasodilatatore. In definitiva, è possibile misurare la costrizione indotta dalla pressione.

Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla terapia o alla diagnosi di ipertensione, ipotensione o disfunzione vascolare. Poiché questa tecnica identifica i meccanismi chiave alla base dei cambiamenti indotti dalla pressione nel tono vascolare, che è un determinante chiave della resistenza vascolare, della perfusione e della pressione sanguigna. Questa procedura sarebbe stata dimostrata dal Dr.Jja, che è un borsista post-medico nel nostro laboratorio.

Iniziare questa procedura caricando una cannula di vetro in un portamicropipette e collegando il supporto per micropipette a una camera di perfusione per preparare la camera di perfusione. Sciacquare con acqua Milli Q, seguita da una soluzione di dissezione per cinque minuti ciascuna. Quindi caricare la camera con due millilitri di soluzione di dissezione.

Successivamente, riempire con cura l'intera cannula e il tubo collegato senza generare bolle. Preparare due suture ciascuna con mezzo nodo utilizzando una pinza smussata al microscopio da dissezione. Utilizzare una pinza di dissezione per caricare entrambe le cannule con nodi di sutura parzialmente chiusi leggermente lontano dalla punta.

Successivamente, eseguire una laparotomia della linea mediana su un ratto anestetizzato dal bacino allo sterno praticando prima un'incisione nella pelle e successivamente praticando un'incisione nello strato muscolare sottostante. Bisogna fare attenzione a non ferire gli organi intraaddominali. Legare entrambe le estremità separatamente per evitare la fuoriuscita di carillon e feci al fine di evitare la contaminazione della soluzione di bagno extracellulare.

Successivamente, tagliare l'estremità prossimale dell'intestino vicino ai pori e l'estremità distale, vicino alla giunzione ileocecale. Quindi praticare un'incisione sul mesenario alla sua base vicino al sistema vascolare di alimentazione. Successivamente, trasferire l'intero letto mesenterico dell'intestino tenue in un becher da 50 millilitri contenente una soluzione di dissezione ghiacciata e incubare per cinque minuti.

Quindi sciacquarlo con una soluzione di dissezione fresca per rimuovere il sangue. Ora appuntate l'estremità prossimale dell'intestino sul lato destro in un piatto rivestito di sarda, estendete l'intestino rimanente in senso antiorario. Fissare il segmento verso il basso per allargare il mesenario ed esporre i vasi sanguigni sotto uno stereomicroscopio zoom.

Sezionare le piccole arterie mesenteriche del terzo e quarto ordine parallele all'intestino tenue rimuovendo prima tutto il grasso di copertura vicino al ramo del secondo ordine. Quindi sezionare la vena e isolare l'arteria con un punto di ramificazione a forma di V. Fare attenzione a non forare il segmento selezionato.

Quindi, isolare una sezione di quattro o cinque millimetri dell'arteria parallela all'intestino tenue. Tagliate tutti i rami del quinto ordine incastrati nell'intestino tenue leggermente lontani dall'origine dei rami e conservatene una porzione. Queste porzioni serviranno come siti di attesa per il trasferimento dei segmenti arteriosi in una camera di perfusione e successivamente guideranno il loro incannulamento.

Quindi tagliare i segmenti arteriosi praticando due incisioni distali ai rami del quinto ordine su ciascun lato dell'arteria e trasferirli nella camera di perfusione. Incannulare un'estremità dei vasi su una micropipetta di vetro tenendo la punta del segmento arterioso con una pinza di dissezione. Far scorrere la sutura parzialmente chiusa precedentemente caricata sull'estremità cannulata e fissarla.

Successivamente, collegare una siringa caricata con soluzione di dissezione da 10 millilitri al rubinetto di arresto collegato a questa cannula. Sollevare delicatamente la siringa. La forza gravitazionale sulla soluzione rimuoverà il sangue intravascolare dall'estremità aperta del vaso.

Dopo aver rimosso il sangue intra arterioso, chiudere il rubinetto di arresto. A questo punto, legare l'estremità distale dei vasi su una seconda cannula di vetro avvicinando con cura l'altra cannula il più possibile all'estremità slacciata del segmento arterioso. Far scorrere la sutura precedentemente caricata e parzialmente chiusa sull'estremità cannulata e fissarla.

Bisogna fare attenzione a non tirare o tirare i segmenti arteriosi e assicurarsi che il fermo Cox attaccato a entrambe le cannule sia chiuso. Trasferire la camera di perfusione sul tavolino del microscopio invertito dotato di registrazione video dal vivo. Quindi collegare il rubinetto di arresto della cannula legata all'estremità prossimale del segmento arterioso a un dispositivo di regolazione della pressione servocomandato.

Assicurarsi che il rubinetto di arresto attaccato all'altra cannula rimanga chiuso per mantenere stabile la pressione intraluminale. Quindi, collegare il tubo del vuoto al tubo di perfusione e la porta di aspirazione alla porta di perfusione della camera. Iniziare a perfondere il recipiente con PSS caldo attraverso il riscaldatore della soluzione in linea singolo a due millilitri al minuto.

Utilizzando una pompa peristaltica, accendere il vuoto e la temperatura del PSS nella camera è vicina ai 37 gradi Celsius. Aumentare lentamente la pressione intraluminale da 20 a 100 millimetri di mercurio. Controllare la presenza di eventuali perdite nel recipiente utilizzando l'impostazione automatica della pressione del regolatore di pressione.

Successivamente, valutare il segmento arterioso per le curve mantenendo la pressione a 100 millimetri di mercurio. Utilizzando la leva a vite, spostare la cannula per raddrizzare il segmento arterioso e non allungare eccessivamente i segmenti arteriosi. Quindi ridurre la pressione a 70 millimetri di mercurio per imitare la pressione in vivo nell'arcata mesenterica e consentire al segmento arterioso di stabilizzarsi e sviluppare il tono miogenico.

In questa procedura, visualizzare l'arteria con un obiettivo 10 x sotto un microscopio dotato di una carica video monocromatica. Coppia la fotocamera del dispositivo. Misura il diametro luminale utilizzando un video frame grabber e un sistema di rilevamento dei bordi in tempo reale.

Quindi registrare il diametro del vaso e monitorare lo sviluppo del tono miogenico. Dopodiché, ridurre la pressione a 20 millimetri di mercurio e lasciare che il diametro si stabilizzi. Quindi aumentare la pressione intraluminale in incrementi incrementali come 20, 40, 60, 80 e 100 e consentire all'arteria di raggiungere un diametro stabile ad ogni pressione.

Successivamente, ripetere la risposta del passo di pressione in PSS privo di calcio contenente 0,39 millimolare EGTA e 0,1 millimolare nitropressa di sodio come indicato dal tracciato, il diametro delle piccole arterie mesenteriche dei ratti diminuisce spontaneamente quando pressurizzato a 70 millimetri di mercurio, l'aggiunta di un micromolare acetilcolina ha aumentato il diametro al diametro iniziale vicino. L'aggiunta di una fenilefrina micromolare al bagno tissutale ha diminuito il diametro arterioso, e questa figura mostra che l'incubazione delle piccole arterie mesenteriche nel PSS libero da calcio aumenta il diametro arterioso. Il diametro di un singolo segmento arterioso pressurizzato in vari otto perfusi è mostrato in questa tabella.

Qui il diametro arterioso viene registrato continuamente aumentando la pressione intraluminale in modo incrementale in presenza di PSS e PSS senza calcio. Ecco le curve del diametro arterioso raggiunto ad ogni fase di pressione e il grafico a barre del tono miogenico raggiunto ad ogni fase di pressione è mostrato qui Off. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come valutare il comportamento miogenico delle piccole arterie di resistenza.

Seguendo questa tecnica, è possibile eseguire ulteriori procedure come l'interruzione endoteliale e la permeazione arteriosa. Entrambe queste procedure possono rispondere a ulteriori domande riguardanti il ruolo dell'endotelio e del calcio nella regolazione del tono vascolare delle piccole arterie di resistenza.