Osservazione e quantificazione dei telomeri e sequenze ripetitive Usando fluorescenza In Situ Ibridazione (FISH) con sonde PNA in Caenorhabditis elegans
4 agosto 2016
Riportiamo una procedura concisa di ibridazione fluorescente in situ (FISH) nella gonade e negli embrioni di Caenorhabditis elegans per osservare e quantificare sequenze ripetitive. Abbiamo osservato e quantificato con successo due diverse sequenze ripetitive, le ripetizioni dei telomeri e il modello di allungamento alternativo dei telomeri (TALT).
L'obiettivo generale di questa tecnica di ibridazione in situ a fluorescenza è quello di analizzare in modo conciso il numero e la lunghezza dei telomeri in C.Elegans. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave sulla regenesi del tumore, sull'allungamento alternativo dei telomeri e sulla senescenza cellulare. Il vantaggio principale di questa tecnica è che le procedure sono concise e i telomeri possono essere visualizzati e quantificati in meno di 24 ore.
Raccogli i vermi adulti gravidi con un po' di terreno liquido senza detriti in un tubo da 15 millilitri. Ora lava i vermi tre volte come segue. Aggiungere il tampone M9 per un volume totale di 15 millilitri.
Quindi centrifugare il tubo a 300 G per tre minuti e scartare la soluzione sopra il pellet di vermi. Quindi ripetere il processo. Se dopo la centrifugazione le viti vengono a galla, alleggerire il freno della centrifuga.
Dopo il terzo lavaggio, lasciare i vermi con 5 millilitri di M9. Quindi aggiungere 6,5 millilitri di acqua distillata, due millilitri di iperclorito e un millilitro di idrossido di potassio a cinque molari. Lasciare incubare i vermi in questa soluzione sbiancante per tre minuti con 50 giri/min di agitazione. Quindi agitare i vermi per tagliarli e liberare le loro uova.
Sotto un microscopio da dissezione, cerca le uova rilasciate. Se non vengono ancora rilasciati, continuare l'incubazione o fino a otto minuti. Se i vermi sono per lo più disciolti e le uova sono libere, riempi il tubo fino a 15 millilitri con M9 e lava le uova tre volte proprio come i vermi sono stati lavati prima.
Alle uova lavate, con la maggior parte dell'M9 rimosso, riempire il volume a 500 microlitri con PBST, quindi aggiungere 500 microlitri di PFA al 4%. Ora caricare 40 aliquote di microlitri di uova in PFA al 2% nei pozzetti dei vetrini rivestiti di polilisina. Quindi trasferire i vetrini in una camera umidificata e lasciarli incubare per 15 minuti a temperatura ambiente.
Per questo protocollo, avere un blocco di alluminio su ghiaccio secco conservato a 80 gradi Celsius. Inoltre, conserva metanolo e acetone a 20 gradi Celsius. Al termine della fase di fissaggio, rimuovere la maggior parte della soluzione di PFA dai vetrini, lasciando circa cinque microlitri.
Quindi posizionare i secondi vetrini rivestiti di polilisina su ciascun vetrino campione in modo che le due superfici rivestite aderiscano insieme, intrappolando i tessuti nel pozzetto. Se c'è un fissativo eccessivo, pulirlo con un fazzoletto. Ora congelate i vetrini posizionandoli sul blocco di alluminio freddo per almeno 15 minuti.
Nel frattempo, preparare bagni di metanolo e acetone con ghiaccio per gli scivoli. Una volta che i vetrini sono congelati, ruotarne uno per congelare il campione. Scartare il vetrino superiore e immergere il vetrino inferiore in metanolo ghiacciato per cinque minuti.
Eseguire questa operazione per tutti i campioni. Il freeze cracking consente la penetrazione delle sonde e degli anticorpi attraverso il guscio duro dell'uovo. Se le uova vengono congelate con successo, potresti vedere le uova su entrambe le diapositive.
Dopo almeno cinque minuti in metanolo, spostare i vetrini sull'acetone freddo per cinque minuti. In altri cinque minuti, immergere i campioni in PBST tre volte per cinque minuti per bagno. Dopo i lavaggi PBST, i vetrini possono essere conservati in etanolo al 100% a quattro gradi Celsius per diversi giorni.
Per procedere, aggiungere 20 microlitri di soluzione di RNasi ai pozzetti del campione e incubarli in una camera umidificata a 37 gradi Celsius per un'ora. Quindi lavare i vetrini in 2x SSCT due volte per 15 minuti per lavaggio. Dopo i due lavaggi, aggiungere 20 microlitri di soluzione di ibridazione ai campioni e incubarli a 37 gradi Celsius per un'ora in una camera umidificata.
Nel frattempo, preparare la sonda per una sonda di DNA a doppio filamento. Denaturarlo a 95 gradi Celsius per cinque minuti e poi raffreddarlo brevemente con ghiaccio. Dopo un'ora, aspirare la soluzione di ibridazione e aggiungere la soluzione della sonda.
Da questo passaggio in avanti, proteggere il campione dalla luce. Dopo aver aggiunto la sonda, coprire i campioni con vetrini. Quindi creare una camera umidificata su un blocco termico a 80 gradi Celsius.
Quando il blocco termico si è stabilizzato a 80 gradi Celsius, posizionare i vetrini del campione nella camera riscaldata e lasciare denaturare per tre minuti. Quindi incubare tutti i vetrini trattati in una camera umidificata a 37 gradi Celsius per una notte. Dopo l'incubazione notturna, lavare i campioni in PBST a temperatura ambiente per cinque minuti.
In preparazione, scaldare la soluzione di ibridazione a 37 gradi Celsius un'ora prima del lavaggio. Quindi caricare i vetrini in un barattolo di soluzione di lavaggio per ibridazione e incubarli a 37 gradi Celsius per 30 minuti. Per rimuovere la soluzione di ibridazione, lavare i campioni con PBST a temperatura ambiente per 15 minuti.
Fallo tre volte. Dopo aver aspirato l'ultimo lavaggio PBST, aggiungere 20 microlitri di soluzione bloccante a ciascun campione e incubarli in camere umidificate a temperatura ambiente per un'ora al buio. Quindi aspirare la soluzione bloccante e sostituirla con una soluzione di anticorpi anti-digossigenina coniugata FITC a una risoluzione su 200.
Coprire i vetrini e incubarli a temperatura ambiente per tre ore al buio. Dopo la colorazione con anticorpi, lavare i campioni due volte con PBST per 15 minuti per lavaggio al buio. Successivamente aspirare il PBST e sostituirlo con 10 microlitri di soluzione di montaggio contenente DAPI.
Applicare un vetro di copertura e assorbire la soluzione in eccesso. Infine, sigillare i bordi del vetro di copertura con lo smalto per unghie e procedere con l'osservazione dei campioni al microscopio a fluorescenza. Utilizzando la sonda PNA, sono stati osservati i telomeri degli animali sopravvissuti a una mutazione sufficiente per i telomeri.
Nelle gonadi, il numero di telomeri per nucleo è quantificabile. Il segnale dei telomeri è co-localizzato con un segnale TALT1, supportando l'idea che TALT1 sia responsabile della sopravvivenza senza telomeri. L'intensità del segnale dei telomeri è stata confrontata utilizzando un software.
Il segnale era più forte nei sopravvissuti all'ALT rispetto ai ceppi parentali utilizzati per generare i mutanti carenti di telomeri. Non dimenticare che lavorare con paraformaldeide e formamide può essere estremamente pericoloso e che durante l'esecuzione di questa procedura è necessario prendere sempre precauzioni, come indossare i guanti.
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Panoramica
Questo articolo presenta una tecnica concisa di ibridazione fluorescente in situ (FISH) per l'analisi della lunghezza e del numero di telomeri in Caenorhabditis elegans. Il metodo consente la visualizzazione e la quantificazione dei ripetuti telomerici e dell'allungamento telomerico alternativo (TALT) in meno di 24 ore.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Biologia cellulare
- Genetica
Sfondo
- I telomeri proteggono le estremità dei cromosomi e sono fondamentali nell'invecchiamento cellulare.
- Comprendere la dinamica dei telomeri è importante per la ricerca sul cancro.
- L'ibridazione fluorescente in situ (FISH) è uno strumento potente per visualizzare il materiale genetico.
- Caenorhabditis elegans si avvale come organismo modello per studi genetici.
Scopo dello studio
- Sviluppare una procedura FISH concisa per C. elegans.
- Quantificare la lunghezza e il numero dei telomeri in un breve lasso di tempo.
- Studiare il ruolo dei telomeri nella rigenerazione tumorale e nella senescenza cellulare.
Metodi Utilizzati
- Prelevamento di adulti gravidi di C. elegans in mezzo liquido.
- Lavaggio dei vermi con tampone M9 per prepararli alla FISH.
- Applicazione della FISH per visualizzare le sequenze telomeriche.
- Quantificazione delle ripetizioni telomeriche e del TALT.
Risultati principali
- Visualizzazione riuscita di ripetizioni telomeriche in C. elegans.
- Quantificazione di due sequenze ripetitive diverse ottenuta.
- Dimostrata l'efficacia della tecnica FISH in breve tempo.
- Forniti spunti sulla biologia dei telomeri rilevanti per la ricerca sul cancro.
Conclusioni
- Il metodo FISH sviluppato è efficace per lo studio dei telomeri in C. elegans.
- Questa tecnica può facilitare la ricerca sulle malattie correlate ai telomeri.
- Studi futuri potranno approfondire le implicazioni della dinamica telomerica.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Questo metodo FISH consente la visualizzazione diretta e la quantificazione della dinamica dei telomeri in un modello multicellulare, supportando la validazione degli obiettivi nella biologia dei telomeri e nei percorsi di allungamento alternativo. Fornendo una risoluzione a livello di singola cellula per sequenze ripetitive, aumenta la sicurezza predittiva negli studi meccanicistici sulla stabilità genomica e sulla senescenza cellulare. L'approccio offre un saggio rapido e che preserva la morfologia, adatto a flussi di lavoro di scoperta precoce incentrati su bersagli legati ai telomeri.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione dell'Obiettivo
- Valore scientifico: Consente l'analisi dei meccanismi di mantenimento dei telomeri, inclusa l'attività della via ALT, per validare ipotesi terapeutiche.
- Valore operativo: Fornisce letture quantitative del numero e della lunghezza dei telomeri per nucleo, utili per la valutazione funzionale della proteina bersaglio.
- Valore predittivo: Permette una valutazione allineata ai biomarcatori dell'instabilità genomica in sistemi rilevanti per la malattia.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Genera segnali FISH standardizzati e riproducibili per le sequenze telomeriche e TALT, consentendo la prontezza del saggio.
- Valore operativo: Fornisce output quantitativi di imaging compatibili con pipeline di analisi ad alto contenuto.
- Scalabilità: Facilita la preparazione di sistemi biologici validati per lo screening di composti successivi.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Collega la visualizzazione dei telomeri all'attività ALT, supportando la riduzione del rischio meccanicistica in modelli preclinici.
- Continuità traslazionale: Permette la correlazione dei segnali telomerici con la co-localizzazione di TALT1 per la validazione del percorso.
- Avanzamento ponderato rispetto al rischio: Supporta decisioni di avanzamento o interruzione basate sulla dinamica telomerica in contesti rilevanti per la malattia.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si inserisce nei flussi di lavoro della fase iniziale di scoperta fino alla preclinica, fornendo una quantificazione dei telomeri che contribuisce a definire la fiducia nel bersaglio e la validazione del percorso prima dell'ottimizzazione del composto leader.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica di ipotesi sulla regolazione della lunghezza dei telomeri e sul meccanismo ALT in C. elegans.
- Screening: Fornisce segnali quantitativi e riproducibili dei telomeri per la standardizzazione dei saggi e la valutazione di composti.
- Analisi: Permette il confronto basato sull'intensità dei segnali telomerici mediante software di analisi delle immagini per letture oggettive.
- Ricerca traslazionale: Collega la dinamica dei telomeri all'attività della via ALT attraverso la co-localizzazione di TALT1 per ottenere informazioni meccanicistiche.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una capacità FISH riutilizzabile per l'analisi di telomeri e sequenze ripetitive in diversi progetti.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Affidabilità predittiva nella biologia dei telomeri, validazione degli obiettivi e riduzione dell'ambiguità meccanicistica nei meccanismi ALT.
- Valore operativo: Standardizzazione, riproducibilità e scalabilità della quantificazione dei telomeri in campioni fissati.
- Valore strategico: Miglioramento delle decisioni di avanzamento o interruzione, efficienza del capitale e riduzione del rischio biologico in fase avanzata nei programmi mirati ai telomeri.
- Impatto sul portafoglio: Prioritizzazione aggiustata per il rischio basata sulla validazione del meccanismo di mantenimento dei telomeri.
Considerazioni sull'implementazione
- Competenze nella microscopia a fluorescenza, nell'ibridazione delle sonde e nella preparazione dei campioni per C. elegans in preparazione intera.
- Necessità di vetrini rivestiti con polilisina, camere umidificate e sistemi di incubazione con controllo della temperatura.
- Esigenza di manipolazione delle sonde PNA, trattamento con RNasi e passaggi di amplificazione del segnale basati su anticorpi.
- Considerazioni per l'adattamento a diversi sistemi modello o tipi di tessuto oltre agli embrioni e ai gonadi.
- I limiti pratici includono la manipolazione di reagenti pericolosi (paraformaldeide, formammide) e la necessità di proteggere i campioni dalla luce durante l'ibridazione.
