Isolamento concomitante di astrociti primari e microglia per l'infezione da parassiti di Protozoi
18 marzo 2020
L'obiettivo generale di questo protocollo è quello di istruire come estrarre, mantenere e dissociare le cellule di astrocite e microglia dal sistema nervoso centrale, seguite da infezione da parassiti protozoi.
Questo protocollo descrive un metodo che si concentra sull'estrazione in parallelo delle due popolazioni di cellule gliali più abbondanti, astrociti e microglia, da topi postnatali. Il nostro metodo differisce dagli altri protocolli precedentemente descritti per l'isolamento di astrociti e microglia perché ci concentriamo sull'ottenimento e l'isolamento di entrambi i tipi di cellule nella stessa estrazione alle stesse condizioni, ottimizzando così l'uso di animali da esperimento e migliorando lo studio dei ruoli relativi per queste cellule in contesti immunologici. Questo protocollo può essere utile per indagare meglio i ruoli di microglia e astrociti in molti contesti e malattie nel sistema nervoso centrale come Alzheimer, Parkinson e infezioni da parassiti o virus protozoi.
Ottenere e isolare entrambi i tipi di cellule dalla stessa estrazione è auspicabile per valutare il ruolo comparativo di ogni sottoinsieme cellulare contesti immunologici come infezione o infiammazione. Le persone dovrebbero stare attenti soprattutto durante la rimozione del cervello e i lavaggi nervosi dei tessuti, ma credo che con questo protocollo e il video girato, le persone non faranno fatica. Questo protocollo può essere lungo a seconda del numero di animali per estrarre i cortici, quindi preparati a trascorrere circa quattro ore o più.
Il primo giorno, prepara HBSS e HBSS puri più FBS inattivati dal calore al 10%. Preparare dmem F12 integrato e filtrarlo con un filtro da 0,22 micron. Sterilizzare tutti gli strumenti chirurgici in autoclave e utilizzare il 70% di etanolo durante la procedura.
Mettere i topi appena nati in una camera sigillata contenente cotone imbevuto di isoflurane per cinque minuti per un'anestesia profonda. Spruzzare il cucciolo di topo con il 70% di etanolo e decapitare l'animale con le forbici. Fai un taglio sagittale con forbici lungo il cranio per aprirlo ed esporre il cervello.
Rimuovere il cervello usando una micro spatola per mantenere l'integrità cerebrale. Posizionare il cervello in una piastra di Petri asciutta di sei centimetri di diametro. Utilizzando una micro spatola, rimuovere il bulbo olfattivo e il cervelletto.
Spostare la corteccia su un'altra piastra di Petri contenente due millilitri di HBSS più 10%FBS. Tagliare il tessuto cerebrale in piccoli pezzi con forbici sterili e utilizzando una micropipetta P1000, trasferire ogni tessuto cerebrale con HBSS più 10%FBS in diversi tubi conici da 15 millilitri. Se necessario, utilizzare HBSS più 10%FBS per riempire il volume finale a due millilitri.
Lavare il tessuto cerebrale tagliato con tre millilitri di HBSS più 10%FBS per ogni tubo. Dopo la decantazione, rimuovere con cura il supernatante. Ripetere il lavaggio con HBSS più 10%FBS tre volte in più.
Quindi lavare con tre millilitri di HBSS puro tre volte. Dopo la decantazione, rimuovere con cura il supernatante. Quindi, aggiungere tre millilitri di tripina e posizionare il tubo in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius per 30 minuti scuotendo delicatamente i tubi ogni cinque minuti.
Questo digerisce il tessuto raccolto. Evitare bolle. Per inattivare la tripsiderina, lavare il tessuto con tre millilitri di HBSS più 10%FBS e dopo la decantazione del tessuto, rimuovere con cura il supernatante.
Ripetere questo lavaggio tre volte. Quindi lavare il tessuto con tre millilitri di HBSS puro e ripetere due volte aggiuntive. Dopo la decantazione del tessuto, rimuovere con cura il supernatante.
Aggiungere sette millilitri di HBSS puro e omogeneizzare il tessuto attraverso passaggi successivi in pipette, prima con una pipetta sierologica da 10 millilitri, seguita da una pipetta da cinque millilitri e infine con una micropipetta P1000. Dopo l'omogeneizzazione, centrifugare i tubi a 450 volte g per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Scartare il supernatante e rimescolare il pellet con quattro millilitri di HBSS più 10%FBS per ogni tubo.
Trasferire le cellule in un pallone T75 pretrattato commercialmente per un'adesione ottimale della coltura cellulare. Posizionare il pallone in un'incubatrice a 37 gradi Celsius al 5% di anidride carbonica per 30 minuti per l'aderenza. Quindi aggiungere 10 millilitri di DMEM F12 integrato al pallone e incubare a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica per due notti.
Il terzo giorno, rimuovere sette millilitri di mezzo di coltura dal pallone T75 e aggiungere sette millilitri di DMEM F12 fresco integrato. Riportare il pallone nell'incubatrice. Il quinto giorno, per rimuovere detriti e cellule non arent, scambiare tutto il mezzo dal pallone T75 con 14 millilitri di DMEM F12 fresco integrato.
Quindi, ogni 48 ore, rimuovere sei millilitri del supernatante e aggiungere sette millilitri di DMEM F12 fresco integrato medio fino al giorno 14 di coltura. Il giorno 14, dopo aver rimosso sei millilitri di supernatante e aver aggiunto sette millilitri di mezzo DMEM F12 integrato fresco, chiudere saldamente i contenitori T75 con un involucro di plastica. Posizionarli nello shaker orbitale del pavimento a 200 RPM e 37 gradi Celsius durante la notte per dissociare meccanicamente le microglia dagli astrociti.
Il giorno 15, prendere i matracci dallo shaker e lavarli vigorosamente con il proprio mezzo al fine di ottimizzare la dissociazione cellulare e raccogliere il numero massimo di microglia. Quindi raccogliere il supernatante e trasferirlo in un tubo conico da 50 millilitri. Successivamente, aggiungere quattro millilitri di tripside ad ogni pallone e incubare per cinque minuti a 37 gradi Celsius per staccare gli astrociti.
Quindi aggiungere cinque millilitri di DMEM F12 integrato per inattivare la tripina. Lavare i contenitori con il proprio mezzo e trasferire il contenuto in un tubo conico da 50 millilitri. Centrifugare tutti i tubi contenenti microglia dissociata o astrociti a 450 volte g per cinque minuti a quattro gradi Celsius.
Scartare il supernatante. Resuspend il pellet di microglia in un millilitro di DMEM F12 integrato e gli astrociti in 10 millilitri di DMEM F12 integrato. Procedere al conteggio delle celle in una camera Neubauer o in un contatore automatico di celle.
Placcare le celle con DMEM F12 integrato alla densità desiderata in una piastra di coltura cellulare piatta pretrattata. Incubare le cellule a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica per 24 ore per consentire loro di attaccarsi. Il 14 ° giorno, la coltura cellulare gliale è stata sottoposta a dissociazione meccanica.
È stato osservato con una purezza dell'89,5% per la popolazione di astrociti e del 96,6% per la popolazione di microglia. Astrociti e microglia di topi C57BL6 sono stati infettati da T.cruzi Y.Dopo due ore, 48 ore e 96 ore, le camere sono state fissate con metanolo e macchiate con marcatore di nucleasi cellulare DAPI e anti-GFAP. L'uso di parassiti geneticamente modificati che esprimono reporter fluorescenti o parassiti etichettati con specifici anticorpi fluorescenti ha migliorato la microscopia ad immunofluorescenza poiché si distinguono meglio dal nucleo cellulare.
Qui vengono presentati due esempi. Ceppo T.gondii RH che esprime in modo costitutivo ceppo YFP e T.cruzi Y macchiato con anticorpo monoclonale non commerciale 2C2 anti-SSP4 proteina. È importante lavare attentamente le cellule per non perdere aggregati cellulari.
Dopo l'infezione da cellule gliali, possono essere valutati altri parametri come ELISA per la produzione di citochine presente nel supernatante, western blotting per l'espressione proteica e PCR quantitativo in tempo reale per la valutazione della trascrizione dell'RNA. Molte domande relative alla funzione delle cellule gliali, ad esempio il loro metabolismo, la risposta immunitaria e la stessa biologia cellulare possono essere affrontate e avvantaggiate da questa tecnica. Tutti i parassiti dei protozoi sono in grado di infettare le cellule umane e di coltura delle cellule del topo, quindi è importante fare attenzione quando si maneggia questo parassita.
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Panoramica
Questo articolo presenta un protocollo dettagliato per l'estrazione, la coltura e l'infezione in parallelo di astrociti e microglia primari di origine murina da cortecce di topi neonati. Il metodo consente ai ricercatori di ottenere entrambi i tipi cellulari gliali dalla stessa estrazione, facilitando studi comparativi sul loro ruolo nelle infezioni del sistema nervoso centrale (SNC), in particolare con parassiti protozoi come Trypanosoma cruzi e Toxoplasma gondii. Il protocollo comprende passaggi per l'isolamento cellulare, il mantenimento della coltura, il fenotipaggio, l'infezione e l'analisi dei tassi di infezione mediante microscopia a fluorescenza.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroimmunologia
- Biologia cellulare
- Parassitologia
Sfondo
- Astrociti e microglia sono le cellule gliali più abbondanti nel sistema nervoso centrale, essenziali per il supporto fisiologico e l'omeostasi.
- Entrambi i tipi cellulari svolgono ruoli significativi nella risposta immunitaria alle infezioni del sistema nervoso centrale.
- Sono necessari metodi migliorati per l'isolamento e lo studio di queste cellule al fine di comprendere meglio le loro risposte ai patogeni.
- Le infezioni protozoarie, come quelle causate da T. cruzi e T. gondii, possono influenzare in modo significativo la funzione del sistema nervoso centrale.
Scopo dello studio
- Fornire un protocollo riproducibile ed efficiente per l'estrazione e la coltura simultanea di astrociti e microglia dai cortici murini.
- Permettere studi comparativi sulle risposte delle cellule gliali alle infezioni protozoarie.
- Facilitare analisi a valle della funzione delle cellule gliali durante l'infezione.
Metodi Utilizzati
- Estrazione delle cortecce da topi neonati in condizioni sterili.
- Dissociazione enzimatica e meccanica del tessuto cerebrale per ottenere sospensioni di singole cellule.
- Coltura in vitro di cellule gliali con sostituzione periodica del mezzo per 14 giorni.
- Dissociazione meccanica per separare i microglia dagli astrociti.
- Fenotipizzazione delle popolazioni cellulari mediante citometria a flusso
- Infezione di cellule in coltura con T. cruzi e T. gondii parassiti
- Valutazione dei tassi di infezione mediante microscopia a fluorescenza con parassiti modificati geneticamente o marcati con anticorpi.
Risultati principali
- Il protocollo consente di ottenere popolazioni ad alta purezza: circa l'89,5% di astrociti e il 96,6% di microglia.
- Entrambi i tipi cellulari possono essere infettati in modo efficiente da parassiti protozoi in vitro.
- La microscopia a fluorescenza permette una chiara visualizzazione e quantificazione dei tassi di infezione in diversi punti temporali.
- Il metodo consente ulteriori analisi, come ELISA, Western blot e qPCR, per studi funzionali.
Conclusioni
- Questo protocollo fornisce un approccio semplice, economico ed efficiente per isolare e studiare astrociti e microglia primari di origine murina.
- Permette il confronto diretto delle risposte delle cellule gliali alle infezioni del sistema nervoso centrale.
- La tecnica apre nuove prospettive per la ricerca neuroimmunologica sulla funzione delle cellule gliali durante infezioni e malattie.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Questo protocollo consente ai team di ricerca e sviluppo biofarmaceutici di isolare simultaneamente astrociti primari e microglia dai cortici di topi, favorendo l'analisi comparativa delle cellule gliali in modelli di infezione del sistema nervoso centrale. Ottimizzando l'uso degli animali e fornendo un flusso di lavoro standardizzato per il fenotipaggio e l'infezione, il metodo migliora la validazione degli obiettivi e la riduzione dei rischi meccanicistici nella ricerca in neuroimmunologia e nelle malattie infettive. L'approccio supporta le attività iniziali di scoperta incentrate sul controllo del patogeno mediato dalle cellule gliali e sulle interazioni ospite-patogeno.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Consente l'analisi delle risposte delle cellule gliali a parassiti protozoi come T. cruzi e T. gondii, per chiarire i meccanismi patogenetici nelle infezioni del sistema nervoso centrale.
- Valore operativo: Supporta la validazione funzionale dei bersagli permettendo il confronto diretto tra i tassi di infezione di astrociti e microglia e il controllo del parassita.
- Conferma predittiva: Facilita lo screening fenotipico delle risposte immunitarie mediate dalle cellule gliali per ridurre i rischi associati ai bersagli nei programmi su malattie neurodegenerative e infettive.
Sviluppo di screening e saggi
- Prontezza del saggio: Genera popolazioni purificate di cellule gliali con una purezza superiore all'89% per gli astrociti e superiore al 96% per le microglia, consentendo saggi di infezione riproducibili.
- Risultati quantitativi: Permette la quantificazione del tasso di infezione mediante microscopia a fluorescenza in diversi punti temporali, per analisi dipendenti da dose e tempo.
- Scalabilità: Utilizza attrezzature e reagenti standard per colture cellulari, consentendo l'adattamento a formati multi-well per lo screening di composti.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Modello di Sistema Rilevante per le Malattie: Fornisce un modello di cellule gliali murine per studiare infezioni protozoarie rilevanti per il sistema nervoso centrale, con rilevanza traslazionale per le condizioni neuroinfiammatorie umane.
- De-risking Meccanicistico: Permette la valutazione del contributo delle cellule gliali alla eliminazione del patogeno, supportando la scoperta di biomarcatori e l'analisi dei percorsi molecolari.
- Continuità Preclinica: Consente il monitoraggio longitudinale dell'infezione da 2 a 96 ore, in linea con le finestre temporali di valutazione preclinica dei candidati terapeutici.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si integra nei flussi di lavoro della fase iniziale di scoperta fornendo cellule gliali validate per la modellizzazione delle infezioni, lo sviluppo di saggi e studi meccanicistici prima dell'ottimizzazione del composto leader.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica di ipotesi sui ruoli specifici delle cellule gliali nell'invasione e nella replicazione dei patogeni nel sistema nervoso centrale.
- Screening: Fornisce cellule gliali standardizzate e fenotipizzate, pronte per saggi di infezione con parassiti marcati con fluorescenza o anticorpi.
- Analisi: Permette la misurazione quantitativa del tasso di infezione mediante microscopia a fluorescenza e analisi successiva dell'espressione di citochine, proteine e RNA.
- Ricerca traslazionale: Collega le risposte delle cellule gliali all'infezione a meccanismi neuroimmunitari più ampi, rilevanti per modelli preclinici di malattia.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma riutilizzabile per l'isolamento di cellule gliali applicabile in programmi su malattie virali, parassitarie e neurodegenerative.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Riduce l'ambiguità meccanicistica nella funzione delle cellule gliali durante l'infezione, consentendo un confronto diretto tra astrociti e microglia provenienti dallo stesso animale.
- Valore operativo: Migliora la riproducibilità e la standardizzazione attraverso un protocollo unificato di estrazione che minimizza la variabilità tra animali.
- Valore strategico: Orienta le decisioni di proseguimento o interruzione fornendo dati predittivi precoci sul controllo del patogeno mediato dalle cellule gliali nei modelli di infezione del sistema nervoso centrale.
- Impatto sul portafoglio: Supporta la priorizzazione corretta rispetto al rischio degli obiettivi sulla base della risposta delle cellule gliali alla sfida con protozoi.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nella dissezione asettica dei tessuti, nella digestione enzimatica e nelle tecniche di dissociazione meccanica.
- Richiede l'accesso a centrifughe, incubatrici, agitatori orbitali e microscopia a fluorescenza per la rilevazione dell'infezione.
- Necessita della standardizzazione dei cambi del mezzo, dei passaggi di lavaggio e dei tempi di dissociazione tra diversi lotti per ottenere rese gliali costanti.
- Comporta considerazioni di adattamento quando si estende il protocollo ad altri sottotipi gliali o modelli di malattia diversi dall'infezione protozoaria.
- È limitato dal periodo di coltura di 14 giorni e dal passaggio di dissociazione meccanica, che potrebbero influire sulla scalabilità per applicazioni ad alto rendimento.
