Ricostituzione dell'attività estrattiva msp1 con componenti completamente purificati
10 agosto 2021
Qui presentiamo un protocollo dettagliato per la ricostituzione dell'attività di estrazione di Msp1 con componenti completamente purificati in proteolipolisi definiti.
L'uso di AAA-ATPasi per rimuovere le proteine da un doppio strato lipidico è un tema comune nel controllo della qualità delle proteine. Una comprensione meccanicistica di questo processo essenziale richiede un sistema ricostituito. La precedente ricostituzione con AAA-ATPasi era complessa ed eterogenea.
Il nostro sistema è semplice e completamente definito. Questo ci permette di manipolare l'AAA-ATPasi Msp1, il substrato e l'ambiente lipidico. Per iniziare, aggiungere tampone di ricostituzione precedentemente preparato, proteine Msp1 e TA purificate e liposomi in un tubo PCR, quindi incubare la miscela su ghiaccio per 10 minuti.
Durante l'incubazione, tagliare la punta di una punta della pipetta P200 a circa 1/8 di pollice di diametro. Quindi, ruotare accuratamente il tubo contenente BioBeads per ottenere una miscela uniforme. Quindi, rimuovere rapidamente il coperchio e utilizzare la punta della pipetta P200 tagliata per trasferire un volume appropriato delle perline in un tubo PCR vuoto.
Una volta completata l'incubazione di 10 minuti per la ricostituzione, utilizzando una punta della pipetta non tagliata, rimuovere tutto il liquido dalle BioBeads. Quindi, trasferire 100 microlitri della ricostituzione nel tubo con le BioBeads e lasciarlo ruotare su una ruota per 16 ore. Il giorno seguente, ruotare il tubo in un PicoFuge per pellettare le perline, quindi trasferire il materiale ricostituito in un tubo PCR pulito e mantenere il tubo sul ghiaccio.
Per rimuovere le proteine che non sono riuscite a ricostituirsi nei liposomi, equilibrare le colonne di spin del glutatione con il tampone di estrazione, che in genere comporta tre cicli di lavaggio con 400 microlitri di tampone, seguiti da centrifugazione per rimuovere il tampone. Quindi, aggiungere cinque micromoli di ciascun chaperone al materiale ricostituito, seguiti da 100 microlitri di tampone di estrazione, portando il volume fino a 200 microlitri. Aggiungere questa miscela alle colonne di spin del glutatione bilanciate, quindi tappare le colonne di spin e ruotarle per 30 minuti, consentendo agli accompagnatori di legarsi alla resina.
Dopo la rotazione, ruotare brevemente le colonne. Raccogli il flow-through, che è il materiale pre-eliminato impoverito di proteine aggregate. Metterlo su ghiaccio e procedere direttamente al test di estrazione.
Preparare i tubi per l'analisi SDS-PAGE. Aggiungere 45 microlitri di acqua distillata doppia al tubo di ingresso, 40 microlitri d'acqua al tubo passante e 16,6 microlitri di buffer di caricamento 4X SDS-PAGE a ciascun tubo. Per il test di estrazione, preparare la reazione di estrazione e portare il volume finale a 200 microlitri con il tampone di estrazione.
Quindi, preriscaldare il test di estrazione in un blocco di calore a 30 gradi Celsius per due minuti. Per iniziare il test, aggiungere ATP a una concentrazione finale di due millimoli. Ruotare il tubo per cinque secondi in un PicoFuge e incubarlo a 30 gradi Celsius per 30 minuti.
Durante l'incubazione, prelevare un campione di cinque microlitri della reazione e aggiungerlo al tubo di ingresso. Inoltre, equilibrare una colonna di spin del glutatione per ciascun campione nel test di estrazione, come dimostrato in precedenza. Una volta completata l'incubazione di 30 minuti, aggiungere 200 microlitri di tampone di estrazione al tubo, portando il volume totale a 400 microlitri.
Quindi, aggiungere questa reazione alla resina di glutatione equilibrata e lasciarla ruotare per 30 minuti a quattro gradi Celsius. Dopo la rotazione, ruotare le colonne per raccogliere il flusso passante, quindi prelevare un campione di 10 microlitri per il tubo passante. Lavare la resina due volte con 400 microlitri di tampone di estrazione, scartando il flusso dopo ogni lavaggio.
Dopo il terzo lavaggio, mantenere il flusso e prelevare un campione di 50 microlitri per il tubo di lavaggio. Quindi, preparare cinque millilitri di tampone di eluizione aggiungendo glutatione ridotto a una concentrazione finale di cinque millimoli nel tampone di estrazione. Aggiungere 200 microlitri del tampone di eluizione alla colonna di spin e incubare per cinque minuti.
Quindi, centrifugare la colonna e raccogliere il flusso attraverso. Ripetere ancora una volta il passaggio di eluizione. Dopo la seconda eluizione, prelevare un'aliquota di 50 microlitri dal campione di eluizione e aggiungerla al tubo di eluizione.
Dopo aver eseguito un western blot, l'efficienza di estrazione può essere determinata confrontando la quantità di substrato nella frazione eluta con la frazione di input. Il segnale nel flusso attraverso mostra una certa variabilità, ma è generalmente simile alla frazione di ingresso e non c'è segnale nella frazione di lavaggio. In genere, vi è un'efficienza di estrazione di circa il 10% per il controllo positivo e un'efficienza di estrazione da uno al 2% per il controllo negativo.
Quando le condizioni di ricostituzione non sono ottimizzate, i livelli di estrazione sono comparabili tra i campioni positivi e negativi. Questa tecnica ha permesso al nostro laboratorio di testare le proprietà biofisiche del substrato influenzano il riconoscimento da parte di Msp1.
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Panoramica
Questo articolo presenta un protocollo dettagliato per la reistaurazione dell'attività di estrazione di Msp1 mediante componenti completamente purificati in proteoliposomi definiti. Lo studio mira a semplificare il processo di reistaurazione delle AAA-ATPasi, che sono cruciali per il controllo della qualità proteica.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Chimica biochimica
- Biologia cellulare
Sfondo
- Le ATPasi-AAA svolgono un ruolo fondamentale nella rimozione di proteine dai bicchieri lipidici.
- Una comprensione meccanicistica di questo processo richiede un sistema ricostruito.
- I metodi precedenti erano complessi ed eterogenei.
- Questo studio presenta un sistema di ricostruzione semplice e completamente definito.
Scopo dello studio
- Manipolare la AAA-ATPasi Msp1 e il suo substrato.
- Creare un ambiente lipidico definito per lo studio.
- Migliorare la comprensione dei meccanismi di estrazione delle proteine.
Metodi Utilizzati
- Preparazione del buffer di riconstituzione.
- Utilizzo di proteine Msp1 e TA purificate.
- Incorporazione di liposomi in un tubo PCR.
- Incubazione della miscela su ghiaccio per 10 minuti.
Risultati principali
- È stato stabilito un protocollo semplice ed efficace per la ricostruzione di Msp1.
- Il sistema definito permette una migliore manipolazione dei componenti.
- È stata raggiunta una comprensione avanzata del processo di estrazione.
- I risultati indicano un'efficienza migliorata nel controllo della qualità delle proteine.
Conclusioni
- Lo studio fornisce un metodo semplice per lo studio delle AAA-ATPasi.
- Contribuisce alla comprensione dell'estrazione delle proteine dalle membrane.
- Questo protocollo può essere applicato a ulteriori ricerche nel controllo della qualità proteica.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Questo protocollo consente la riduzione dei rischi meccanicistici nell'estrazione di proteine mediata da AAA-ATPasi, un percorso conservato di controllo della qualità rilevante per l'omeostasi proteica mitocondriale. Fornendo un sistema completamente definito e ricostruito con componenti purificati, supporta la validazione degli obiettivi terapeutici e lo sviluppo di saggi per malattie associate a disfunzioni mitocondriali, inclusa la neurodegenerazione e il cancro. L'approccio aumenta la fiducia predittiva nelle fasi iniziali della scoperta isolando le variabili che influenzano il riconoscimento del substrato e l'efficienza dell'estrazione.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Consente l'analisi del ruolo di Msp1 nella rimozione di proteine ancorate alla coda mallocalizzate, supportando la validazione funzionale di bersagli nelle vie di proteostasi mitocondriale.
- Valore operativo: Utilizza Msp1 purificato, proteine TA e liposomi per eliminare la complessità cellulare, permettendo una manipolazione precisa dell'ambiente di ATPasi, substrato e lipidi.
- Valore predittivo: Facilita l'analisi struttura-funzione del riconoscimento del substrato da parte di Msp1, contribuendo all'identificazione di composti promettenti per modulare l'attività di estrazione delle proteine.
Sviluppo di Screening e Saggi
- Valore scientifico: Stabilisce un saggio di estrazione quantitativo in cui l'efficienza viene misurata confrontando i livelli di substrato nell'eluito rispetto al campione iniziale mediante Western blot.
- Valore operativo: Definisce condizioni standardizzate: incubazione ghiacciata di 10 minuti per la ricostituzione, rotazione di 16 ore con BioBeads ed estrazione guidata da ATP di 30 minuti a 30°C seguita da eluizione con glutathione.
- Prontezza del saggio: I risultati includono l'efficienza di estrazione (tipicamente ~10% per il controllo positivo, 1–2% per il controllo negativo), consentendo la rilevazione di risultati positivi e lo screening dose-risposta in un formato ricostituito.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Rilevanza traslazionale: Collega i meccanismi della proteostasi mitocondriale a modelli di malattia in cui la disfunzione di Msp1 è implicata nel cancro, nell'invecchiamento e nelle malattie neurodegenerative.
- De-risking meccanicistico: Isola le variabili che influenzano l'estrazione—come la composizione lipidica e la biofisica del substrato—per chiarire l'interazione con il bersaglio e ridurre l'ambiguità nella validazione preclinica del bersaglio.
- Continuità: Favorisce il passaggio dalla validazione biochimica del bersaglio allo screening fenotipico in sistemi rilevanti per la malattia, definendo un modulo di estrazione minimo e controllabile.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questo metodo si inserisce nel percorso iniziale della scoperta, consentendo la validazione dell'obiettivo attraverso l'analisi meccanicistica dell'estrazione delle proteine, il che orienta lo sviluppo di saggi per le cascade di screening e supporta decisioni di avanzamento o interruzione basate sull'interazione con la proteina bersaglio e sulla modulazione del percorso biologico.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica di ipotesi su come l'ambiente lipidico e le caratteristiche del substrato influenzino l'attività ATPasica di Msp1 e l'efficienza di estrazione.
- Screening: Fornisce una piattaforma quantitativa reconstituita per valutare gli effetti di composti sull'estrazione mediata da ATPasi, con controlli positivi e negativi ben definiti.
- Analisi: Genera output misurabili—efficienza di estrazione tramite confronto tramite Western blot delle frazioni eluite e di input—permettendo confronti statistici tra diverse condizioni.
- Ricerca traslazionale: Stabilisce un collegamento con la rilevanza preclinica modellando un percorso conservato di controllo qualità la cui alterazione è associata a malattie umane.
- Riutilizzo aziendale: Il sistema definito reconstituito con liposomi consente il riutilizzo in diversi progetti che studiano le AAA-ATPasi, la specificità del substrato o la modulazione lipidica dell'estrazione.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva riducendo l'ambiguità meccanicistica nei percorsi di estrazione delle proteine attraverso un sistema semplificato e definito.
- Valore operativo: Migliora la riproducibilità e la standardizzazione grazie a componenti purificati e a un protocollo passo-passo (ricostituzione, trattamento con BioBead, pre-eliminazione mediante chaperone, estrazione guidata da ATP, eluizione con glutathione).
- Valore strategico: Migliora il processo decisionale di avanzamento o abbandono del progetto consentendo una valutazione precoce del potenziale di modulazione del bersaglio prima di saggi cellulari o fenotipici.
- Impatto sul portafoglio: Supporta la priorizzazione dei bersagli in base al rischio nei processi di controllo della qualità mitocondriale, chiarificando la responsabilità meccanicistica e l'accessibilità del bersaglio.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nella purificazione delle proteine, nel reimpacchettamento in liposomi e nella progettazione di saggi dell'ATPasi.
- Richiede l'accesso a ultracentrifugazione o PicoFuge per la formazione del pellet, colonne di glutathione su spin, e blocchi riscaldanti a temperatura controllata.
- Necessita della standardizzazione della composizione lipidica, dei rapporti proteina:lipide e della concentrazione di ATP tra diversi laboratori per garantire un'efficienza di estrazione riproducibile.
- L'adattamento ad altre proteine TA o ad altre AAA-ATPasi potrebbe richiedere l'ottimizzazione del tampone di reimpacchettamento, del tempo di incubazione e dei passaggi di delipidificazione dei lipidi su microcolonne.
- I limiti pratici includono la variabilità del segnale nel flusso passante e la dipendenza dalla sensibilità del Western blot per substrati a bassa abbondanza, come indicato nella fonte.
