One-step purificazione di proteine ​​Twin-Strep-taggate e dei loro complessi su Strep-Tactin resina reticolato con Bis (Sulfosuccinimidil) suberato (BS3)

Ciao, sono Christina McKennan dell'Università di Helsinki, in Finlandia. Una delle sfide nella caratterizzazione di un particolare complesso proteico è determinare la sua composizione molecolare. Ciò richiede lo sviluppo di metodi per isolare e purificare il complesso dal suo ambiente cellulare.

L'area di ricerca nei microbi sono le interazioni tra virus e ospite delle piante e quindi siamo interessati ai vari complessi proteici nucleari di ripon virale che si formano durante l'infezione. In passato, abbiamo studiato con successo questi complessi utilizzando la purificazione basata su condotti di affinità nelle nostre mani. Il dotto streptococco gemello si è rivelato una delle migliori anatre.

Tuttavia, abbiamo osservato alcune limitazioni nel suo utilizzo, una delle quali è la bassa resa e quindi abbiamo voluto migliorare questo metodo. Ciao, mi chiamo Mata e ti guiderò attraverso il protocollo sperimentale. Ma prima, lascia che ti dia una panoramica del metodo.

Impieghiamo macroperline di preparazione per lo streptococco tachinico per purificare complessi specifici tra le proteine gemelle marcate con streptococco e i loro partner fisiologici di legame. Lo streptococco marcato e il tetramero sono mostrati in verde proteina marcata con streptococco gemello in blu, il suo partner di legame in arancione e due copie del tag streptococco. In rosso.

Le proteine non legate raffigurate come paure di grazia vengono rimosse mediante lavaggio nell'approccio canonico. I complessi legati sono allusi in modo competitivo con la biotina mostrata in rosa. Tuttavia, durante l'utilizzo di questo approccio, abbiamo osservato un'eluizione incompleta di complessi legati con solo una frazione che si stacca con successo dalle perle di tachino streptococco.

Ciò si traduce in un basso recupero delle proteine bersaglio. A complicare qualsiasi ulteriore analisi, il recupero della proteina bersaglio può essere migliorato utilizzando l'eluizione denaturante con S-D-S-S-D-S. Le cellule Miss si formano attorno alla proteina esca gemella denaturata dello streptococco.

Il suo partner di legame e attorno ai monomeri dissociati dell'actina strept. La contaminazione del campione risultante con actina strept rilasciata è inaccettabile se il campione deve essere ulteriormente analizzato mediante spettrometria di massa. Per superare il problema della contaminazione del campione, abbiamo sviluppato un metodo in base al quale il tetramero dello streptotatina viene prima stabilizzato mediante reticolazione chimica.

La resina reticolata risultante viene utilizzata per purificare la proteina esca e l'eluizione del campione del suo partner legante con SDS garantisce un elevato recupero proteico, mentre la reticolazione chimica della resina assicura l'eluizione della proteina esca marcata con strept e il suo legame. Partner in assenza di contaminazione del campione con lo strept equilibrato rilasciato sigillato in nessun modo. Microprovetta contenente due milligrammi di reticolante BS a temperatura ambiente.

Preparare un puntale per pipetta per il trasferimento della resina tagliando l'estremità del puntale, risospendere la resina per streptococco e macro con una breve e vigorosa agitazione e trasferire immediatamente 600 microlitri di sospensione in una centrifuga a colonna filtrante CoStar spinx a 4.000 giri/min per 30 secondi. A temperatura ambiente aggiungere 450 microlitri di soluzione salina tamponata con fosfato. Lo scopo di questa fase è quello di sostituire la triss media primaria con un fosfato non reattivo.

Scartare il flusso attraverso. Mescolare il contenuto girando più volte il tubo. Ripetere le fasi di centrifugazione e lavaggio due volte e lasciare la resina in 430 microlitri di P-B-S-P-H otto.

Dopo l'ultima centrifugazione, forare la pellicola della microprovetta no way con un puntale per pipetta contenente 100 microlitri di milli Q.Water Sciogliere la polvere BS three in acqua pipettando delicatamente su e giù. Una volta che il BS three è completamente sciolto, aggiungere immediatamente 20 microlitri di soluzione alla colonna di spin X. Assicurarsi che il contenuto sia miscelato correttamente.

Ruotare la colonna per 30 minuti a temperatura ambiente, assicurandosi che la resina sia miscelata correttamente con la soluzione BS three. Per spegnere la reazione, aggiungere sei microlitri di triss a tre molari regolati a pH 7,5 con acido cloridrico. Ruotare la colonna per altri 15 minuti a temperatura ambiente e centrifugare a 4.000 giri/min per 30 secondi.

A temperatura ambiente, sospendere la resina reticolata in 450 microlitri di soluzione salina tamponata tris con tween 20 e scartare il flusso. Ripetere le fasi di centrifugazione e lavaggio altre due volte All'ultimo passaggio, risospendere la resina in 450 microlitri di TBS. Trasferire la sospensione di resina in una nuova provetta, risospendere la resina rimasta nella colonna con altri 450 microlitri di TBS e trasferire nella stessa provetta.

Ripetere ancora una volta l'ultimo passaggio per garantire il massimo trasferimento della resina dalla colonna al tubo. Lasciare riposare il tubo con la sospensione di resina per 10 minuti a temperatura ambiente e regolare il volume a 600 microlitri. Rimuovendo il TBS in eccesso, la resina è pronta per l'uso immediato o può essere conservata a quattro gradi Celsius senza congelamento.

Questo metodo è adatto per la purificazione di qualsiasi proteina di fusione marcata con streptococco gemello e dei suoi complessi associati. La proteina può essere di origine animale, vegetale o batterica e può essere isolata sia dal lisato cellulare totale che dalla frazione organoclanica arricchita. In questo esempio, isoliamo una proteina gemella VPG Pro del virus della patata A dalla frazione nucleare delle piante infette da virus, iniziamo centrifugando un millilitro del campione di proteina esca in un tampone legante a 13.000 giri/min per 10 minuti a quattro gradi Celsius.

Trasferire il surnatante in una provetta nuova per ridurre al minimo il legame delle proteine biotinilate endogene allo streptococco e alla resina. Aggiungere avadon a una concentrazione finale di 100 microgrammi per millilitro, assicurandosi che il contenuto sia ben miscelato. Ruotare per 15 minuti a quattro gradi Celsius.

Risospendere la resina reticolata mediante vortice e, utilizzando una punta per pipetta a tazza, aggiungere immediatamente 50 microlitri della sospensione di resina alla provetta contenente il campione di proteine dell'esca. Ruotare per altri 30 minuti a quattro gradi Celsius durante l'attesa. Impostare il termomiscelatore a 55 gradi Celsius e preriscaldare 500 microlitri di tampone Elu da utilizzare nella centrifuga a gradini elucian a 2000 giri/min per un minuto a quattro gradi Celsius.

Scartare il surnatante e lavare la resina con un millilitro di tampone di lavaggio pre-raffreddato. Numero uno, ruota per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Ripetere le fasi di centrifugazione e lavaggio tre volte nell'ultimo passaggio.

Risospendere la resina in 250 microlitri di tampone di lavaggio numero due e trasferire la sospensione di resina in una nuova colonna spinx. Risospendere la resina rimasta nella provetta in altri 250 microlitri di tampone di lavaggio numero due e trasferire nella stessa centrifuga a colonna a 2000 RPM per tre minuti a quattro gradi Celsius. Trasferire la colonna in un tubo da due millilitri fresco a naso di delfino e scartare il flusso.

Procedere immediatamente al passaggio eluciano successivo. Aggiungere 150 microlitri di tampone di eluizione preriscaldato alla colonna spinx. Incubare la soluzione nel termomiscelatore per cinque minuti a 55 gradi Celsius, agitando a 1400 giri/min, centrifugare a 4, 000 giri/min per un minuto a temperatura ambiente e scartare la colonna.

Le proteine bersaglio purificate sono ora pronte per ulteriori analisi e possono essere conservate a meno 20 gradi Celsius se l'immagine dimostra che l'eluizione proteica dalla resina di preparazione macro dell'actina strept con biotina è incompleta rispetto all'eluizione con SDS. La differenza nelle intensità del segnale western blot riflette le diverse rese proteiche ottenute con le due tecniche eluciane. Sebbene elucian con SDS sia molto più efficiente di elucian con biotina, porta alla contaminazione del campione con actina strept rilasciata.

L'immagine mostra il gel colorante d'argento di SDS EIT dalla nota di resina di preparazione Strept actin Macro, la presenza di actina strept rilasciata nella corsia di sinistra ma la sua assenza nella corsia di destra. Il campione a sinistra è stato alluso dalla resina non reticolata e il campione a destra dalla resina reticolata con BS tre. Sulla base di questi risultati, concludiamo che la reticolazione con BS 3 impedisce il rilascio di actina strept dalla resina durante l'eluizione SDS.

In questo esempio abbiamo utilizzato la resina di macro preparazione Strept actina reticolata con BS three per purificare la proteina esca VPG PRO e i suoi partner leganti. Un'aliquota del campione purificato è stata sottoposta ad analisi spettrometrica di massa per l'identificazione delle proteine. L'assenza di una banda specifica nel controllo negativo conferma la specificità del pull down.

La banda inferiore corrisponde alla proteina esca VPG PRO e la banda superiore al suo partner di legame NIB replicato identificato mediante spettrometria di massa. Ciao, ti abbiamo appena mostrato come la reticolazione chimica può essere utilizzata per superare i limiti associati al Dena e all'illusione dello streptococco nella resina. Oltre alla purificazione di complessi proteina-proteina, il metodo può essere utilizzato anche per purificare complessi proteici con acidi nucleici, compresi quelli reversibili reticolati con formaldeide.

Infine, il metodo può essere utilizzato per purificare le proteine di membrana dello strep tech. Solubilizzato con detergenti. I detergenti sono necessari per mantenere queste proteine idrofobiche in soluzione.

Tuttavia, la loro presenza può portare alla contaminazione del campione con il rilascio di streptococco. Anche quando si utilizza una lieve evoluzione della biotina, riteniamo che la reticolazione della resina possa fornire una soluzione al problema della contaminazione del campione. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i tuoi esperimenti. Ok.