Valutare motilità delle cellule staminali neurali L'utilizzo di un gel a base di Agarose dispositivo a microfluidi

Ciao, sono Kevin won. Sono uno studente del corso di laurea magistrale in ingegneria presso il Biofluids Lab della Cornell University. Oggi parlerò dell'utilizzo di un dispositivo microfluidico basato su agarosio per studiare l'effetto del fattore di crescita epidermico (EGF) sulle cellule staminali neurali murine.

Il dispositivo consiste fondamentalmente in tre canali microfluidici, ciascuno largo 150 micron. L'EGF viene pompato in uno dei canali laterali e il tampone viene pompato nell'altro canale laterale. Fondamentalmente, ciò stabilisce un gradiente chimico lineare statico attraverso il canale centrale.

Dato che l'EGF diffonde facilmente attraverso il gel di agarosio, le cellule staminali neuronali vengono seminate nel canale centrale e il progresso della loro migrazione viene monitorato mediante microscopio. I dispositivi sono quindi composti essenzialmente da uno strato superiore in plexiglass che presenta tutti gli ingressi e le uscite per il collegamento ai tubicini. Al di sotto di questo si trova una membrana di gel di agarosio, che contiene quattro dispositivi modellati al suo interno.

Questo è circondato da un distanziatore in PDMS, che garantisce uno spessore costante in tutto il dispositivo. Il PDMS e il gel sono assemblati su un vetrino di vetro, rivestito con ect. Ciò aiuta le cellule ad aderire al vetrino.

Inoltre, la piastra in acciaio inossidabile viene utilizzata per montare l'intero dispositivo e noi assembliamo il dispositivo a sandwich mediante viti. La linea cellulare di tipo selvaggio è stata trasfettata con un vettore retrovirale per sovraesprimere il recettore EGF di tipo selvaggio, mentre la linea cellulare delta è stata trasfettata con una versione mutata del recettore EGF che ne consente l'attività costitutiva anche in assenza del ligando EGF. Ok, comincerò spiegando il processo di assemblaggio del nostro dispositivo microfluidico.

Quindi, ho prima posizionato lo spaziatore in PDMS attorno alle caratteristiche in rilievo dei microcanali in silicio nei nostri master. Ora peserò 0,3 grammi di agros. Ora preleverò 10 ml di mezzo indipendente dal CO2 e li aggiungerò all'agros.

E ora pipetterò su e giù per mescolare la polvere di aros con il mezzo indipendente da CO2. Ora siamo pronti per il forno a microonde. Come potete vedere, l'agros è ora liquefatto, ma rimangono ancora alcune granulazioni.

Cercherò di mescolare delicatamente per sciogliere il granello ed eliminare le bolle d'aria. Verso quindi l'agarosio fuso sulle strutture in rilievo del master in silicio e ora prendo un vetrino sterile che pongo sopra lo spaziatore in PDMS. Lo posiziono con un angolo inclinato per cercare di espellere la maggior parte delle bolle d'aria presenti nel gel di agarosio.

E ho applicato pressione e continuerò ad applicare pressione fino a quando il guscio di agarosio non si sarà solidificato. Dopo uno o due minuti si è solidificato. Ora rimuoverò l'agarosio in eccesso dal vetrino.

Il passo successivo consiste nello scivolare delicatamente via il vetrino, che può quindi essere smaltito. Ora proverò a trasferire delicatamente il pattern di agros su un vetrino che ho precedentemente ricoperto con fibronectina. Utilizzo essenzialmente questo foglio sterile di plastica per aiutarmi a sollevare il pattern di agros con lo spaziatore in PDMM MS e trasferirò il pattern di agros con i canali rivolti verso il basso rispetto al vetrino.

Ora che questo è saldamente fissato sul vetrino, praticherò dei fori nei singoli serbatoi in modo che la piastra di distribuzione in plastica abbia accesso ai canali. Lo farò utilizzando un piccolo perforatore metallico. Ora abbiamo terminato di praticare i fori nel dispositivo.

Aggiungerò 500 microlitri di mezzo indipendente da CO2 per evitare la disidratazione dei microcanali e lascerò riposare per uno o due minuti. Bene, dopo uno o due minuti, cercherò di rimuovere il mezzo in eccesso e ora allineerò i fori realizzati nel pattern agros con i fori di ingresso e uscita del collettore in plexiglass. Una volta allineati i fori, premerò con fermezza per formare un’adeguata tenuta.

Ora posiziono la piastra in plexiglass sopra i supporti in acciaio inossidabile e successivamente assemblo delicatamente il dispositivo utilizzando delle viti. Presto molta attenzione a non stringere eccessivamente le viti, poiché ciò potrebbe schiacciare i canali; inserisco le viti in senso orario per evitare che il gel Agros all'interno si incastrì. Preleverò un millesimo di mezzo e utilizzerò questa siringa per testare il dispositivo.

E come puoi vedere, sto iniettando del fluido in ogni microcanale e verifico che il fluido fuoriesca da ciascuna uscita. Al momento ho posizionato il dispositivo assemblato nella camera ambientale del microscopio. Questa è mantenuta a 37 gradi Celsius, quindi riscalderà il dispositivo e lo preparerà per il momento in cui dovremo seminare le cellule.

E come potete vedere, ho già fatto passare i tubi della pompa parasole attraverso il sistema. Al momento sto lavando i tubi con PBS in preparazione ai nostri esperimenti. Ora procederemo quindi a configurare i tubi.

Infilo il tubo della pompa ombrello nei tappi con i fori già praticati. Ogni tubo presenta un numero specifico di tacche che mi permettono di identificare sia l'ingresso che l'uscita del tubo. Quindi, il tubo con quattro tacche riceverà 10 nanogrammi per millilitro.

La soluzione di EGF verrà ora collegata al dispositivo tramite il tubo. Lo collegherò a ciascun dispositivo in base al numero di tacche presenti, in modo che corrisponda alla soluzione che sta prelevando.

Ora collego il tubo di uscita. Utilizziamo un tubo in teflon trasparente per assicurarci che il mezzo stia effettivamente scorrendo attraverso il tubo di uscita e che non vi siano ostruzioni nel canale. Ora avvierò le pompe parasol.

Ora inizierò la procedura per seminare le cellule nel canale centrale. Comincerò rimuovendo il mezzo in eccesso dal canale del sensore. Ora osserverò le cellule.

Le cellule si trovano già in sospensione in un mezzo indipendente dal CO2. Ero io a seminare, ho seminato 60 nell'ingresso del canale centrale e ho seminato 20 microlitri nell'uscita. Si spera che le cellule si depositino grazie a un flusso guidato dalla gravità.

E ripeterò questa procedura per gli altri due canali sensibili e ora osserveremo al microscopio per verificare se l'adesione cellulare è avvenuta con successo. Le cellule si sono ora attaccate al vetrino e, in pochi minuti, inizieranno a espandersi assumendo la loro morfologia caratteristica. Oggi abbiamo quindi trattato il montaggio del dispositivo, la preparazione dei reagenti e le tecniche microscopiche che utilizzo per acquisire immagini della migrazione cellulare all'interno del dispositivo.

In conclusione, speriamo che questo dispositivo possa avere un'ampia diffusione, in particolare in ambito clinico. La figura uno è disposta orizzontalmente. Mostra le traiettorie delle cellule C 17.2 e l'aumento delle concentrazioni di EGF in direzione verticale.

Mostra le traiettorie delle diverse ceppi cellulari C17.2 utilizzati nei nostri esperimenti con la stessa concentrazione di EGF. I dati relativi alle cellule progenitrici mostrano un picco di motilità al gradiente di concentrazione di EGF di 10 nanogrammi per millilitro, indicando che i recettori si sono saturati con il ligando a una concentrazione maggiore di EGF. I dati del tipo selvatico mostrano invece un aumento della motilità alla concentrazione di 100 nanogrammi per millilitro di EGF.

Ciò indica che i recettori non si saturano a concentrazioni elevate di EGF. Questo è logico, poiché sono stati progettati per sovraesprimere il recettore per l'EGF. Infine, i dati della linea cellulare delta indicano che la motilità delle cellule è approssimativamente indipendente dalla concentrazione di EGF.

Questo era inoltre previsto, poiché i recettori del fattore di crescita epidermico mutati sono stati progettati per attivarsi indipendentemente dalla presenza di EGF.