Un metodo per 2-Photon Imaging del flusso sanguigno nella neocorteccia attraverso una finestra del cranio

La capacità di ottenere immagini della vascolarizzazione cerebrale e registrare la dinamica del flusso sanguigno nel cervello intatto di roditori vivi è una tecnica potente che può essere applicata allo studio dell'ischemia cerebrale o della fisiologia cerebrale normale. Qui dimostreremo come utilizzare due tecniche di microscopia ottica per visualizzare la dinamica del flusso sanguigno nella neocorteccia di topi vivi, impiegando coloranti fluorescenti iniettati nella vena della coda. Questa tecnica è stata originariamente sviluppata da David Kleinfeld a Winfred Dank.

Ciao, sono Ricardo Mota del Laboratorio di Carlos Porter Cayo del Dipartimento di Neurologia dell'Università della California di Los Angeles. In un video precedente, vi abbiamo mostrato il metodo per l'implantazione di una finestra cranica per esperimenti di imaging cronico in vivo. Oggi vi mostreremo la procedura per l'acquisizione delle dinamiche del flusso sanguigno nella corteccia cerebrale attraverso una finestra cranica.

Questa preparazione è molto utile perché consente di ottenere immagini in profondità all'interno del cervello mediante microscopia laser a due fotoni. Cominciamo dunque. Per visualizzare la vascolarizzazione cerebrale, gli animali devono essere iniettati per via endovenosa con un colorante fluorescente.

Utilizziamo coloranti coniugati a destrano perché il residuo di destrano impedisce al colorante di attraversare la barriera ematoencefalica e di fuoriuscire dai vasi sanguigni. I topi vengono anestetizzati con isoflurano, al 4% per l'induzione e dall'1,5% al 2% durante l'iniezione. Successivamente, la coda viene disinfettata con tre tamponi al 70% di alcol; tramite un ago da 26 gauge, vengono iniettati da 75 a 100 microlitri di una soluzione al 5% di Destrano R domine disciolto in soluzione fisiologica attraverso la vena della coda.

A metà circa del tratto caudale, gli animali possono essere sottoposti a imaging immediatamente dopo l'iniezione endovenosa nella coda, fino all'escrezione del colorante nell'urina, che diventerà rosa se si utilizza il colorante ERO domine. Circa due ore dopo l'iniezione del colorante fluorescente Dexter, il topo viene anestetizzato con isoflurano: nuovamente al 4% per l'induzione e dall'1 al 1,5% per l'imaging. Il topo viene fissato saldamente, mediante una barra in titanio, al piano del microscopio, che è dotato di un tappetino riscaldante a regolazione termica per mantenere l'animale al caldo.

Viene applicato un unguento oculare per mantenere gli occhi umidi. La lamella di vetro della finestra cranica viene pulita con alcol al 70%. La finestra viene posizionata parallela al piano focale e centrata nel campo visivo.

Con l'obiettivo 4x, è preferibile scattare una fotografia dei vasi sulla superficie del cervello utilizzando una fotocamera digitale. Questa immagine verrà utilizzata come riferimento nelle successive sessioni di imaging per individuare ripetutamente la stessa area d'immagine giorno dopo giorno. L'obiettivo 4x viene quindi sostituito con un obiettivo ad immersione in acqua 40x.

Senza muovere il palchetto, viene acquisita l'immagine digitale della vista. Nuovamente, le coordinate del manipolatore del palchetto vengono impostate a zero. Utilizziamo Scan Image come software per l'acquisizione delle immagini.

Questo è stato scritto in MATLAB da Tom Paul Rudo e Bernardo Sabatini nel laboratorio di Carls Voto. Successivamente accendiamo tutte le altre apparecchiature: il laser, il misuratore di potenza, i tubi fotomoltiplicatori, gli amplificatori, ecc. L'area della finestra adatta all'acquisizione di immagini viene scansionata brevemente a basso ingrandimento per individuare le regioni migliori.

Dopo averli identificati, si acquisisce una serie a basso ingrandimento della regione scelta da immaginare e si annotano le coordinate XY per registrare la dinamica del flusso sanguigno in vasi piccoli o capillari. Utilizziamo scansioni lineari lungo almeno 40 micron del vaso di interesse. Queste singole scansioni della durata di un secondo vengono effettuate usando la minima potenza laser possibile, e si annotano le coordinate e l'angolo di scansione.

Al termine della sessione di imaging, l'animale viene trasferito in una camera riscaldata dove può riprendersi dall'anestesia. Qui mostriamo una serie di cento immagini acquisite ogni cinque micron con il nostro microscopio a due fotoni attraverso una finestra cranica posizionata sopra la corteccia somatosensoriale di un topo di cinque mesi a cui era stata iniettata r Domine dextran attraverso la vena della coda. Questa sequenza di immagini mostra la rete complessa di vasi sanguigni di grandi e piccole dimensioni, inclusi i capillari.

Abbiamo appena mostrato un metodo per la visualizzazione della dinamica del flusso sanguigno in vivo attraverso una finestra cranica. Questo è un metodo estremamente potente per l'acquisizione di immagini della dinamica del flusso ematico cerebrale nella vascolatura corticale, ad esempio per studiare le alterazioni del flusso sanguigno dopo un ictus. Possono essere effettuate multiple acquisizioni in diversi momenti nei BUL mediante iniezioni ripetute nella vena della coda del colorante fluorescente.

Quando si esegue questa procedura, è importante ricordare di lavorare nelle condizioni più pulite e sterili possibile e di avere una mano molto ferma. Ok, e questo è tutto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con il tuo esperimento.