Il metodo MODS per la diagnosi di tubercolosi e di tubercolosi multiresistente

Per ogni tre persone nel mondo, una è infetta da tubercolosi. La diagnosi della tubercolosi attiva previene nuove infezioni perché i pazienti con tubercolosi attiva possono infettare tra 10 e 15 altre persone all'anno, fino al momento in cui vengono trattati o muoiono. MODS è un acronimo che utilizziamo per evitare di dover dire "osservazione microscopica, saggio di suscettibilità ai farmaci", e il motivo per cui è chiamato così diverrà chiaro man mano che verrà spiegata la metodologia.

Nel breve video, illustreremo la metodologia MODS per la diagnosi rapida ed economica della tubercolosi e della tubercolosi multiresistente. Il video presenterà la metodologia passo dopo passo. Discuteremo le implicazioni di biosicurezza legate al lavoro con colture liquide e spiegheremo anche alcune importanti questioni relative al controllo di qualità necessarie per l'utilizzo di questa metodologia.

Il saggio mods è stato sviluppato alla Kayana University di Lima, in Perù, nel laboratorio di Bob Gilman. In seguito a osservazioni inizialmente effettuate da loose cavi, LOOSE stava cercando di identificare metodi rapidi per rilevare il Mycobacterium tuberculosis in colture, utilizzando indicatori colorimetrici.

Ma ha osservato che l'osservazione di tali colture al microscopio rivelava la presenza di crescita di micobatteri diversi giorni prima che gli indicatori colorimetrici cambiassero colore, ed è su questa osservazione che è stato sviluppato il test MOD. Il test MOD è stato sviluppato in un contesto con risorse limitate ed è destinato a contesti con risorse limitate, con un costo di poco inferiore a 3 dollari per test per il rilevamento della tubercolosi mediante coltura liquida e il rilevamento della resistenza a più farmaci. È estremamente interessante e per la prima volta rende disponibile questo tipo di capacità diagnostica in luoghi dove le risorse sono limitate.

Quindi, il saggio MODS si basa su tre principi fondamentali. Il primo è che Mycobacterium tuberculosis cresce in un mezzo liquido molto più rapidamente rispetto a quanto avvenga in un mezzo solido. Si tratta di un fatto noto da molti anni.

Il secondo aspetto è che, osservando tali terreni liquidi al microscopio, possiamo rilevare la crescita di *M. tuberculosis* molto più rapidamente rispetto all'attesa della comparsa macroscopica di colonie su terreni solidi. E in effetti, tale crescita è del tutto caratteristica, tanto da permetterci di distinguere *M. tuberculosis* in terreni liquidi da contaminazioni batteriche o fungine, o addirittura dalla crescita di micobatteri atipici non tubercolari che potrebbero essere presenti. Infine, e questo è forse l'aspetto più interessante del saggio MODS, possiamo incorporare direttamente dal campione di espettorato i farmaci come la rifampicina e quindi rilevare la resistenza a più farmaci.

Utilizzando questi farmaci all'inizio del saggio, possiamo rilevare sia la tubercolosi sia, contemporaneamente, se l'isolato è resistente o meno a questi due farmaci. Ciò elimina la necessità di effettuare un'esubcoltura e di realizzare un test indiretto di suscettibilità ai farmaci. Ora illustreremo l'equipaggiamento necessario per eseguire il saggio MODS.

È necessario un frigorifero per conservare i terreni preparati. È richiesta una bilancia per pesare l'is e la rifampicina. È necessario un vortex per mescolare l'espettorato.

Per la soluzione di decontaminazione, è richiesta una centrifuga per concentrare il campione di espettorato decontaminato, che deve essere in grado di raggiungere 3000 G. La centrifuga non necessita di refrigerazione, ma è assolutamente essenziale che sia biosicura e conforme ai requisiti di biosicurezza. Per lavori con micobatteri, è necessario che i contenitori della centrifuga possano essere sigillati con coperchi bloccabili. È richiesto un incubatore in grado di raggiungere e mantenere una temperatura di 37 gradi centigradi.

Questo non deve necessariamente essere arricchito di CO2. È richiesto un microscopio invertito per leggere le piastre mods, che dovrebbe essere dotato di obiettivi 4x e 10x; è inoltre necessario un autoclave per sterilizzare i mezzi e per lo smaltimento delle colture microbatteriche. Sono richieste micropipette per il prelievo di aliquote nei mezzi e una cappa a sicurezza biologica. È richiesta una cappa di classe due per le procedure che prevedono la manipolazione di campioni di espettorato e l'inoculazione delle piastre.

I reagenti necessari per eseguire il saggio mods sono i seguenti: terreno Middlebrook 7H9, additivo casitone e glicerolo PANTA, che è il supplemento antibiotico, e OADC. I supplementi nutrizionali degli antibiotici sono e Rifampicina dimetilsulfossido, DMSO per la preparazione della rifampicina, idrossido di sodio, citrato di sodio e N-acetilcisteina per la decontaminazione dell'espettorato, diidrogenofosfato di sodio e monoidrogenofosfato di potassio per la preparazione del tampone fosfato, ipoclorito di sodio al 10% per lo smaltimento dei rifiuti infetti e disinfettante per la pulizia delle superfici di lavoro. Sono inoltre necessarie le seguenti materie plastiche e articoli monouso: tubi di vetro sterili, filtri da 0,2 micrometri per solventi acquosi e filtri da 0,2 micrometri per solventi organici, provette per microcentrifuga, provette da 15 ml per centrifuga, pipette sterili da 50 millilitri e da 10 millilitri, punte sterili per micropipetta, piastre tipo coltura cellulare a 24 pozzetti e sacchetti sigillabili di tipo Ziploc in cui vengono inserite le piastre a 24 pozzetti dopo l'inoculazione del campione di espettorato nel terreno.

Esistono quattro gruppi di soluzioni madri che possono essere preparate in anticipo. La soluzione tampone fosfato è composta da una miscela di soluzioni di fosfato di sodio, diba e fosfato monobasico di potassio, aggiustata a un pH di 6,8 ± 0,2. Questa soluzione viene sterilizzata in autoclave a 121-124 gradi centigradi per 15 minuti e un'aliquote viene coltivata su agar nutriente per confermare la sterilità.

Questo può essere conservato in frigorifero da due a otto gradi centigradi per un massimo di un mese. Ogni campione di espettorato richiede 10 millilitri di soluzione tampone fosfato. La soluzione madre per la decontaminazione dell'espettorato è una combinazione di idrossido di sodio e citrato di sodio.

Queste soluzioni vengono miscelate in volumi uguali e sterilizzate in autoclave a 121-124 gradi centigradi per 15 minuti e possono essere conservate anche in frigorifero a due-otto gradi centigradi per un periodo massimo di un mese. Per ogni campione di espettorato è necessario 2 mL di questa soluzione. Il terreno di coltura di base è costituito da Middlebrook 7H9 con casitone e glicerolo.

La polvere di H nine sette viene disciolta in acqua distillata sterile contenente glicerolo e cascione e mescolata con agitazione costante fino a completa dissoluzione. Questo terreno viene sterilizzato in autoclave a 121-124 gradi centigradi per 15 minuti e, dopo raffreddamento, suddiviso in aliquote da 4,5 millilitri in provette di vetro sterili da 16 × 100 millimetri. Il terreno viene incubato a 37 gradi per 48 ore per verificarne la sterilità, indicata dall'assenza di torbidità dopo questo periodo, e può essere conservato a 2-8 gradi centigradi con tappo ben chiuso per un massimo di un mese.

Ogni campione di espettorato richiede un tubo contenente 4,5 millilitri di questo terreno di coltura. Le soluzioni stock di antibiotici per il terreno sono preparate come segue: sciogliere completamente in acqua distillata sterile e filtrare con un filtro da siringa da 0,2 micrometri per solventi acquosi. Aliquote da 20 microlitri possono quindi essere conservate in tubi microcentrifuga sterili a meno 20 gradi centigradi per un massimo di sei mesi; ogni aliquota da 20 microlitri è sufficiente per fino a cento campioni.

Soluzioni stock di rifampicina a otto milligrammi per millilitro vengono preparate sciogliendo la rifampicina in DMSO e acqua distillata sterile. Questa miscela viene filtrata mediante un filtro a siringa da 0,2 micrometri per solventi organici e la soluzione può essere conservata in aliquote da 20 microlitri in provette microcentrifuga sterili a meno 20 gradi centigradi per un periodo fino a sei mesi. Ogni aliquota da 20 microlitri è sufficiente per fino a 100 campioni. Passiamo ora alla parte relativa alla metodologia vera e propria e ai tre passaggi che è necessario seguire nel giorno della procedura.

Questa operazione consiste nel convertire le soluzioni stock in soluzioni di lavoro. Innanzitutto abbiamo la soluzione di decontaminazione, poi la soluzione del terreno di coltura. Infine, le soluzioni di lavoro dei farmaci isen e Rifampicina.

Il metodo di decontaminazione, utilizzato per la metodologia mods, è la metodologia standardizzata di decontaminazione con idrossido di sodio nalk. L'nalk è un mucolitico, che aiuta a digerire l'espettorato e permette all'idrossido di sodio di svolgere la decontaminazione. A tal fine, è necessaria la nostra soluzione madre di idrossido di sodio e citrato di sodio, a cui vengono aggiunti 0,1 grammi di NA in 20 ml di tale soluzione.

Ogni soluzione che non viene utilizzata nel giorno di preparazione deve essere scartata. La preparazione finale del mezzo di coltura deve essere effettuata esclusivamente nel giorno di utilizzo. Il mezzo H nine conservato viene combinato con OADC e panta; 4,5 millilitri del mezzo vengono combinati con 0,5 millilitri di OADC e 0,1 millilitri di Panta in ogni provetta.

Questo è sufficiente per un campione. Le soluzioni lavorative di ciascun farmaco vengono preparate nel giorno d'uso e tutte le soluzioni non utilizzate devono essere scartate poiché l'attività non può essere garantita. Gli aliquote vengono diluiti in modo seriale in piastre per colture cellulari da 24 pozzetti con il mezzo sette H nove oh A DC, in modo che la concentrazione finale nel pozzetto, raggiunta dopo l'aggiunta del campione di espettorato con il mezzo, sia di 0,4 microgrammi per millilitro di acido forico e di 1 microgrammo per millilitro di rifampicina.

Passiamo ora alla procedura di decontaminazione: due millilitri di campione di espettorato vengono posti in un tubo conico tipo Falcon e quindi aggiunti due millilitri della nostra soluzione decontaminante a base di idrossido di sodio. Il coperchio viene richiuso e avvitato saldamente, dopodiché la sospensione viene agitata al vortex e lasciata in riposo per 15 minuti, periodo durante il quale avviene la decontaminazione. Trascorso questo tempo, vengono aggiunti 14 millilitri di soluzione tampone al fosfato.

Il coperchio viene riposizionato e avvitato bene, e il tubo viene inserito nella centrifuga dopo 50 minuti a 3000 G; il soprannatante S viene decantato e il pellet rimanente costituisce il campione che desideriamo seminare utilizzando i tubi da 5,1 millilitri di sette H nine OEDC panter. Il nostro pellet viene risospeso a un volume di circa due millilitri. Metà di questo campione risospeso viene conservata come riserva in un tubo da microcentrifuga.

Questo è quindi disponibile nel caso in cui la nostra coltura diventi contaminata e dobbiamo riseminare il campione. L'altro millilitro viene aggiunto ai rimanenti sette H nine oh a DC panter presenti nel nostro tubo di vetro, e questo costituisce il nostro campione pronto per la semina. 900 microlitri di questa sospensione di mezzo e campione vengono depositati in ciascuna delle quattro pozzette di una colonna di una piastra a 24 pozzette.

I restanti pozzetti della piastra a 24 pozzetti vengono riempiti con i campioni successivi in modo che cinque campioni occupino una piastra a 24 pozzetti, uno per ciascuna delle cinque colonne, mentre la sesta colonna rimane senza campione. La sesta colonna funge da controllo negativo; in questa colonna vengono aggiunti tutti i componenti del mezzo senza campione di espettorato e qualsiasi crescita visibile indica chiaramente un problema di contaminazione incrociata, rendendo necessario lo scarto dell'intera piastra.

Ogni piastra che utilizziamo richiede una colonna di controllo negativo. Ora abbiamo la nostra piastra contenente tutti i campioni e il mezzo. Dobbiamo aggiungere le sospensioni di antibiotico in una piastra separata.

Abbiamo preparato le nostre diluizioni di Rifampicina e Isid come precedentemente descritto e, utilizzando una pipetta multicanale, preleviamo 100 microlitri da ciascuna di queste pozzette e distribuiamo 100 microlitri di sette H nove OADC in ciascuna delle due pozzette di controllo e 100 microlitri di Rifampicina e 100 microlitri di Isid in ciascuna delle due pozzette contenenti il farmaco. Una volta completata la piastra, il coperchio viene riposizionato e questa viene inserita all'interno di un sacchetto Ziploc; da questo momento in poi, il sacchetto non viene più aperto e, di conseguenza, qualsiasi coltura che cresca in mezzo liquido non ha mai l'opportunità di uscire dal sacchetto.

Tutte le letture della piastra da ora in poi vengono effettuate all'interno del sacchetto, e il sacchetto viene posto in un sacchetto per autoclave e smaltito al termine della coltura. In questo modo, evitiamo la manipolazione di sospensioni altamente concentrate di micobatteri. Illustreremo ora brevemente il controllo di qualità.

Esistono controlli di qualità integrati nella metodologia mods, essenziali per l'uso corretto del saggio. Prima di tutto, vi sono controlli negativi, eseguiti su ogni singola piastra. Questi sono stati già menzionati in precedenza, ma in sintesi, abbiamo una colonna contenente tutti i componenti del mezzo senza la presenza di un campione di espettorato, insieme ad altri cinque campioni di espettorato su una piastra. Le pozzette della colonna devono essere esaminate esattamente come tutte le altre pozzette; la presenza di qualsiasi crescita in queste pozzette indica che si è verificata una contaminazione incrociata e, di conseguenza, nessun risultato ottenuto sulla piastra può essere considerato attendibile.

La piastra deve quindi essere scartata e tutti i campioni devono essere ripiastrellati. Inoltre, sono presenti controlli interni che fungono da controlli positivi. Questi vengono eseguiti su una piastra separata, che viene preparata dopo aver completato la preparazione di tutte le altre piastre campione alla fine della giornata, al fine di ridurre al minimo il rischio di contaminazione incrociata all'interno del laboratorio.

In questa piastra separata, eseguiamo una ceppa completamente sensibile di Mycobacterium tuberculosis e una ceppa resistente all'ISID e alla rifampicina. Se vi sono preoccupazioni riguardo all'uso di una ceppa multiresistente su una piastra, può essere utilizzata una ceppa resistente solo alla rifampicina al posto di queste due ceppi sensibili e multiresistenti. Lo scopo di queste ceppi è dimostrare non solo che il terreno supporta la crescita – pertanto tutti i nostri controlli positivi dovrebbero mostrare crescita nel terreno privo di farmaci – ma anche che le concentrazioni dei farmaci sono corrette; di conseguenza, i controlli positivi sensibili non dovrebbero crescere in presenza di IS e rifampicina, mentre i controlli positivi resistenti dovrebbero ovviamente crescere alle concentrazioni di rifampicina e IS presenti nella piastra.

Ok, passiamo ora alla lettura delle piastre. Se consideriamo come giorno zero il giorno dell'inoculo dei nostri campioni, la lettura delle piastre inizia al giorno cinque. Prima di tale data, la crescita micobatterica è molto raramente osservabile.

Le piastre vengono esaminate al microscopio ottico invertito. Ciò significa che le piastre vengono osservate dal basso verso l'alto, il che ci permette di vedere molto chiaramente i cordoni; al contrario, l'osservazione delle colture dall'alto risulta difficoltosa a causa della condensa presente sul coperchio delle piastre e anche perché la lunghezza focale di un microscopio standard non è adeguata. L'esame microscopico viene generalmente effettuato con l'obiettivo 10x; si considera positiva una coltura in cui siano presenti almeno due unità formanti colonie in entrambe le pozzette senza farmaco.

La presenza di contaminazione è facilmente riconoscibile perché il mezzo diventa torbido e, al quinto giorno, generalmente si verifica una sovracrescita nella maggior parte della pozzetta. Al contrario, la crescita micobatterica non provoca torbidità della pozzetta; la crescita iniziale dei micobatteri forma piccole strutture simili a virgole, che progrediscono costantemente fino a formare caratteristici cordoni o grovigli. Entro due settimane, una crescita fortemente positiva avrà formato conglomerati di micobatteri con cordoni visibili chiaramente solo alle estremità.

La stragrande maggioranza delle colture che diventeranno positive lo è entro il giorno 14; pertanto, si consiglia di effettuare letture giornaliere dal giorno cinque al giorno 14 e, successivamente, letture ogni due o tre giorni in base al carico di lavoro del laboratorio. Nel giorno in cui una coltura risulta chiaramente positiva nei due pozzetti privi di farmaco, si devono leggere anche i pozzetti contenenti il farmaco. Qualsiasi crescita in presenza di uno dei due farmaci indica resistenza a quel farmaco. È molto importante notare che se la lettura dei pozzetti contenenti il farmaco viene effettuata più di una settimana dopo aver rilevato una coltura positiva nei pozzetti privi di farmaco, questo potrebbe non rappresentare una vera resistenza, poiché talvolta si osserva una crescita spontanea.

Le letture possono essere interrotte al giorno 21 se una coltura è negativa, poiché non si riscontrano mai colture positive dopo questo periodo nei pazienti che non ricevono terapia. Al termine dei 21 giorni di incubazione, le colture possono essere eliminate. Le colture rimangono all'interno dei loro sacchetti Ziploc e vengono collocate in sacchetti per l'autoclavaggio, quindi sottoposte ad autoclave a una temperatura compresa tra 121 e 124 gradi centigradi per 45-60 minuti, dopo di che possono essere smaltite in sicurezza. Vorrei ora dire alcune parole sulla sicurezza biologica e sul saggio MODS, poiché stiamo introducendo il MODS non solo in Perù, ma anche in contesti dell'Africa e dell'Asia.

Si pone spesso un quesito riguardo alla sicurezza e alla biosicurezza nell'uso di colture microbatteriche in mezzi liquidi. Si tratta di una preoccupazione comprensibile, poiché ovviamente i liquidi possono essere versati, mentre i mezzi solidi non comportano questo rischio; inoltre, esiste il pericolo di aerosolizzazione quando si maneggiano sospensioni di micobatteri. Proprio per questi motivi riteniamo che la metodologia mod sia più sicura rispetto a qualsiasi altra metodologia che richieda un test indiretto di suscettibilità ai farmaci.

Il motivo è che, per il test indiretto di suscettibilità, viene preparata una sospensione di microbatteri a concentrazione nota. Ciò comporta pertanto la manipolazione di soluzioni altamente concentrate di microbatteri, con tutti i rischi connessi di fuoriuscita e formazione di aerosol. Al contrario, la metodologia MODS, come avrete ora visto, prevede semplicemente l'inoculazione di un campione di espettorato nella nostra piastra, dopo di che la piastra viene sigillata all'interno di un sacchetto di plastica.

Questa busta non viene mai più aperta e, di conseguenza, non dobbiamo gestire queste sospensioni altamente concentrate. Ciò non significa che riteniamo la metodologia mod completamente sicura: manipolare micobatteri comporta sempre un rischio. Tuttavia, i dati provenienti dalla Corea pubblicati nel 2006 sembrano aver confermato la nostra posizione secondo cui i mod non sono più pericolosi della semina di qualsiasi altra coltura.

Questo era uno studio condotto su operatori di laboratorio, che ha mostrato come i rischi professionali per gli operatori che seminavano colture e non avevano responsabilità nel test di suscettibilità ai farmaci non fossero maggiori rispetto a quelli che eseguivano la microscopia diretta dell'espettorato. Al contrario, coloro che manipolavano sospensioni di micobatteri ed eseguivano test di suscettibilità ai farmaci presentavano tassi molto più elevati di rischio professionale di tubercolosi. È chiaramente di importanza fondamentale che tutto il personale del laboratorio sia protetto il più possibile, e raccomandiamo pertanto fortemente che nessuna di queste procedure venga eseguita senza un'adeguata protezione respiratoria individuale, intendendo con ciò mascherine conformi allo standard N95.

Inoltre, è necessaria una cappa di sicurezza biologica di classe due o una cappa in cui tutte le aree di scarico siano filtrate attraverso filtri HEPA. Infine, un meccanismo semplice ma molto importante per evitare turbolenze del flusso d'aria all'interno di un laboratorio è un lucchetto sulla porta del laboratorio, che impedisce l'ingresso e l'uscita del personale durante l'elaborazione dei campioni. Ciò riduce il rischio di trasmissione all'interno del laboratorio. Spero quindi che vi sia stata fornita una buona panoramica su cosa comporti la metodologia MODS e su quanto possa essere utile in contesti con risorse limitate, ma in cui siano urgentemente richiesti test diagnostici di alta qualità per la tubercolosi e la tubercolosi multiresistente (MDR TB).

Per ulteriori informazioni, è possibile visitare il nostro sito web, mods peru. org, dove troverete le nostre procedure operative standard dettagliate e la guida utente per mods. Oltre alle procedure operative standard per l'elaborazione di campioni extrapleurici, disponiamo anche di una raccolta fotografica di micobatteri e tubercolosi, altri micobatteri e contaminazioni batteriche e fungine; inoltre, potrete trovare la nostra strategia di assicurazione della qualità e la procedura che raccomandiamo per l'accreditamento dei laboratori che desiderano iniziare a utilizzare mods.

Infine, è disponibile un foglio di domande frequenti e accogliamo con favore eventuali commenti da parte degli utenti che attualmente utilizzano le mod, poiché si tratta di una metodologia iterativa. Come spiegato in precedenza, si tratta di un test non proprietario e siamo sempre interessati ai miglioramenti che altri laboratori sono riusciti ad apportare.