ゼブラフィッシュ胚におけるmRNAおよびモルホリノアンチセンスオリゴヌクレオチドのマイクロインジェクション。

この手順では、まずモルフォリノおよびin vitro転写したキャップ付きmRNAを調製します。マイクロピペットにモルフォリノ含有溶液を吸引して満たし、マイクロメーター付きの一細胞ステージを用いて注入量を校正します。その後、ゼブラフィッシュの胚を回収し、卵黄へのマイクロインジェクションのためにマイクロインジェクションチャンバーに配置します。

作製した作動溶液を細胞の直下の卵黄に注入し、細胞質流を利用して溶液を細胞微量注入部位まで運搬させます。続いて、溶液を細胞質内に注入します。胚をE3培地中で28.5 °Cでインキュベートし、その後の段階で目的の表現型を確認します。

こんにちは。私はイェール大学医学部遺伝学部門、Dr. Sashaの研究室で研究を行っておりますShiloh Yuenです。本日は、ゼブラフィッシュにおけるmRNAの過剰発現およびモルフォリノオリゴヌクレオチドを用いた遺伝子ノックダウン研究を行うための、堅牢なマイクロインジェクション技術について解説します。私たちの研究室では、嚢胞性腎疾患における一次繊毛の役割を研究するためにこの手法を用いています。

それでは始めていきましょう。遺伝子機能研究における強力なアプローチの一つに、in vitro 転写されたキャップ付きRNAをゼブラフィッシュ胚にマイクロインジェクションする方法があります。本デモンストレーションでは、EGFPタグ付き転写産物をマイクロインジェクションし、胚全体のGFP発現をライブで観察することで、インジェクションが成功したかどうかの可視的な指標として利用します。

まず、目的の転写産物を用いてin vitro キャップRNA転写反応を行います。当研究室では通常、目的のcDNAをpCS2+ベクターに挿入し、mMESSAGE mMACHINE SP6キットを用いて大量のキャップ付きRNAのin vitro 合成反応を行います。次に、RNeasy Mini Kitを用いた精製、あるいはフェノール・クロロホルム抽出およびイソプロパノール沈殿によってRNAサンプルを精製します。

RNA調製物の濃度を慎重に測定し、注射当日まで-80°Cで保存します。RNAサンプルを融解し、軽くボルテックスした後、短時間遠心して集液します。次に、滅菌水を用いて、フェノールレッドの最終濃度が0.025〜0.05%となる作業溶液を調製します。フェノールレッドは、胚への溶液注入を確認するための可視マーカーとして機能します。

ここでは、0.05% phenol redを含む100 ng/µLのEGFP mRNA作業溶液を調製します。最後に、作業サンプルを氷上に保持し、RNAストックを-80 °Cに戻してください。このサンプルの注入準備ができ次第、morphoの調製に進んでください。

モルフォリノアンチセンスオリゴヌクレオチドは、標的タンパク質の翻訳を阻害したり、pre-mRNAのスプライシングを修飾したりすることで、遺伝子発現を改変するために広く使用されています。ゼブラフィッシュにおけるモルフォリノは、遺伝子機能をノックダウンさせる強力な逆遺伝学ツールとして機能します。本手順では、pkd2の翻訳開始部位を標的としたモルフォオリゴをマイクロインジェクションします。通常、Gene Tools LLC社から入手した、目的の遺伝子用に特異的に設計された300 $\mu$Mのモルフォオリゴを使用します。

次に、100 µLの滅菌水を加えて3 mMのストック溶液を作成し、溶液を分注して、注射当日に使用するまで-20 °Cで保存します。morino溶液を65 °Cで5分間加熱します。その後、直ちに氷上で急冷し、短時間遠心分離します。このステップにより、オリゴの二次構造が変性し、溶液が完全に溶解することが保証されます。

次に、Morpho溶液を滅菌水で希釈し、最終濃度を0.025〜0.05%のphenol redとして、作動液を調製します。本デモンストレーションでは、0.5 millimolarのPKD2 Morphinoと0.05%のphenol redを含む作動液を調製します。作動液は室温で保持し、サンプルの注入準備が整った段階でマイクロピペットへの充填を行ってください。

まず、注入に使用するマイクロピペットを作製します。これは、マイクロピペットプラーを用いてBOSケイ酸ガラスキャピラリーチューブを加熱・延伸させることで行います。ニードルを延伸させた後、少量の粘土または粘着テープを敷いたペトリ皿に保管します。

次に、くさび形の溝が形成された3枚のXE three培地プレートに1.5%アガロースを流し込み、マイクロインジェクション用チャンバープレートを作成します。これにより、注入中に胚を容易に保持することができます。その後、アガロースチャンバープレートを凝固させ、使用するまで4°Cで保存します。

マイクロピペットへの充填を開始します。解剖顕微鏡の50倍の倍率でわずかに確認できる程度の開口部を作るため、ピンセットまたは外科用カミソリで遠位端を切断します。次に、調製した作業液を2 µL分注入します。

カバーガラスの上に滴下した溶液に対し、マイクロピペットの背面を、チューブ付き皮下注射針を装着した5 mLシリンジに接続し、マイクロピペットの先端をワーキングソリューションの液滴にわずかに浸します。この際、マイクロピペットのチップを破損させないよう注意してください。シリンジのプランジャーを引くことで、ワーキングソリューションをマイクロピペットの先端からサイフォンで吸引します。

次に、マイクロピペットの注入量を校正します。マイクロメータースライドの上にミネラルオイルを1滴滴下し、圧力パルスマイクロインジェクター装置の電源とエアサプライをオンにします。続いて、マイクロピペットをマイクロインジェクター装置のマイクロピペットホルダーに取り付けます。

マイクロインジェクターは圧力制御されており、解剖顕微鏡の下にあるフットペダルを押すことで注入が行われます。マイクロインジェクターを用いて、マイクロメーターオイルの上にワーキングソリューションを1滴滴下し、注入量を確認してください。オイルの上に球状に浮いた滴の直径を測定します。

注入時間と圧力を調整し、注入量を慎重に校正してください。このステップは、マイクロインジェクション実験の再現性を高めるのに役立ちます。本デモンストレーションでは、すべてのマイクロインジェクションを液滴直径 0.15 millimeters で行います。

最後に、注入量を校正したら、マイクロインジェクターのホールドノブを使用して、マイクロピペットの逆流や漏れを防ぎます。次に、ゼブラフィッシュの胚を準備します。ゼブラフィッシュはランダムに交配するため、準備を開始する毎朝の最初の数時間以内に、1細胞期の胚を回収し、1X E3培地に配置します。

3 mLの転送ピペットを使用して、マイクロインジェクションチャンバープレートの楔形トラフに沿って胚を配置します。培地を除去し、胚が浸水しすぎず、浅く浸っている状態にします。この操作により、胚がトラフの底に沈降しやすくなり、またマイクロピペットによる卵膜（corion）の貫通が容易になります。

それでは、注入を開始します。まず、解剖顕微鏡下で1細胞期胚の細胞質が見えるように、マイクロピペットを用いて胚を操作します。マイクロピペットのチップを破損させないよう注意しながら、まず卵膜を貫通し、次に卵黄を貫通させて胚に注入します。

このデモンストレーションでは、まず細胞の直下の卵黄にマイクロインジェクションを行い、細胞質流と拡散によってワーキングソリューションを細胞内に導入します。ワーキングソリューションにフェノールレッドを添加しているため、この流れを視認することができます。これは単細胞胚であるため、フリーハンドまたはマニピュレーターを用いて注入することが可能です。

また、細胞質への直接注入についても実演します。細胞への直接的なマイクロインジェクションはより確実な方法ですが、胚の適切な向きの調整とマイクロインジェクション技術が必要となるため、時間がかかります。細胞膜は卵黄膜よりも強固であるため、卵黄側からマイクロピペットを挿入して細胞に到達させる方が迅速に完了することが多くあります。

動物極を溝の底に向け、震えない手で慎重に行うことが、この注入法において有効です。マイクロインジェクション後、胚をE3培地を入れたペトリ皿に移し、正常な発生を促すため28.5 °Cでインキュベートします。その後の数時間から数日間の胚発生過程において、目的の表現型が現れるか観察してください。

マイクロインジェクションの成功を確認するため、シールド期からin vivo全胚蛍光顕微鏡を用いて、発生中の胚におけるGFPの発現をモニタリングします。コンストラクトの発現は胚発生の初期段階で最も強く、発生が進むにつれて減衰することが多くあります。これは、注入されたキャップ付きRNAが徐々に分解されるためであり、発現したタンパク質の安定性に依存します。既報の結果に基づき、PKD2モルフィノによって、PKD2変異ゼブラフィッシュに見られるような背側体軸の湾曲が再現され、受精後約2〜3日で腎嚢胞が出現することが期待されます。

ゼブラフィッシュにおいて、mRNAの過剰発現およびモルフォリノオリゴヌクレオチドによる遺伝子ノックダウン研究を行うための、堅牢なマイクロインジェクション法について解説しました。この操作を行う際は、安定した手つきで注入することが重要である点に留意してください。以上となります。

ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りしております。