ゼブラフィッシュの幼虫の複数の困難な標的組織をトランスフェクションするために心室インジェクションを用いた遺伝子モルホリノアプローチを逆転

この手順の全体的な目標は、心室注射を介してモーフィングenoオリゴヌクレオチドを幼虫、コドルフィンに送達し、遺伝子をノックダウンして再生中の機能を評価することです。これは、最初に幼虫に麻酔をかけ、それらをアロスカビの溝に入れることによって達成されます。次に、注射針を心室に挿入します。

次に、モルフォ溶液を心室に4〜6回注入し、パルス間の重み付け間隔を空けて心臓のクリアリングを可能にします。最後に、蝶ヒレを切断し、3日間再生させます。最終的には、オープンソースソフトウェアであるFiji image Jのライントレースツールを使用してフィンの再生面積を測定することにより、フィンの再生への影響を評価できます。

トランスジェネシスや突然変異誘発のような既存の方法よりもこの技術の主な利点は、それが直接注入に適していない幼虫組織のミノスによる遺伝子のノックダウンを可能にすることです 0.75ミリメートルの直径のガラス毛細血管を使用して、針の引き手に入れ、時計職人のピンセットで次のパラメータで針を引っ張ります。 そして、マイクロメータ接眼レンズ付きのステレオスコープの下で、引っ張られた毛細管を壊して直径20マイクロメートルの針を作ります。次に、結合したゴム製の紡績車を備えた旋盤を使用して針を研ぎ、20マイクロメートルのベベルを生成します。凍結乾燥モルフォを1つのXPBSに溶解して、モルフォストックを最終濃度7.5ミリモルまで調製します。

モルフォ注入液2.5マイクロリットルと1ミリモルエンドポーター原液2.8マイクロリットルを組み合わせてモルフォ注入液を混合し、最終濃度3.5ミリモルモルフと0.5ミリモルエンドポーターを注入します。先端が10マイクロリットルのマイクロピペットを使用して、面取りされたガラス針に5マイクロリットルのモルフォ溶液をロードします。次に、ガラス針を空気圧ピコポンプに接続されたマイクロマニピュレーターのニードルホルダーに挿入します。

注射の角度を約45度に調整して、針を一方向に動かすだけで済むようにします。次に、マイクロインジェクターの値を次のように設定します。保持圧力は 20 ポンド/平方インチ、または PSI 射出圧力は 15 PSIA 100 ミリ秒のゲーティング範囲、周期値は 1.9 で、これは 10.9 ミリ秒に相当します。1つのXPBSに溶かした1.5%arosを20ミリリットル調製し、10cmのシャーレに注ぎます。

次に、溝のある射出成形金型を温かいarosに配置して、硬化したゲルに溝を形成し、幼虫を麻酔します。それらを100ミリリットルの水槽水に入れ、トリカン1リットルあたり20ミリグラムを入れます。触覚に反応しなくなったら、プラスチック製の牧歌的なピペットを使用して、幼虫を湿ったアロス型の溝に慎重に移し、腹側が溝の垂直アロス壁に面するようにします。

アロスプレートを実体顕微鏡の下に置き、心室が注射針の反対側を向くようにします。.次に、針を下げて、心室に約1〜2マイクロメートル挿入します。深く挿入しすぎないように注意してください。

次に、3ナノリットルのモルフォ溶液のパルスを心室と重りに注入して心臓をクリアにし、注射後にさらに5パルスを繰り返す前に、針を取り外して、乾燥を防ぐために1つのXPBSを含むシャーレに入れます。次に、E three培地で満たされた移し替えピペットを使用して、幼虫を新鮮なE three培地が入ったシャーレに慎重に戻し、細胞内のモルフォの取り込みと維持を確保します。実験期間中、12〜24時間ごとに注射を繰り返して、注射を評価します。

魚に麻酔をかけた後、E 3メディウムで覆われた平らで濡れたアロスプレートに魚を置き、明視野と蛍光を備えた実体顕微鏡を使用して画像を撮ります。Fiji Image Jフリーソフトウェアを使用して再生用の画像を分析して、ライントレースツールを使用して、発生した再生成長の量を判断します。まず、ファイルをメインメニューのフィジーのメインウィンドウにドラッグアンドドロップして、画像を調整します。

ドロップダウンメニューの[分析]をクリックして、すべての画像のスケールを設定します。「スケールを設定」をクリックし、チェックボックスをクリックしてグローバルオプションをオンにします。次に、画像を再度ドラッグアンドドロップして、ツールバーの再生成長量を測定します。

フリーハンド選択ツールを選択し、測定する領域を囲みます。最後に、Ctrl M.Thisを押すと、囲まれた領域の値を正方形のピクセルで表示する新しい結果ウィンドウが開きます。ここで見られるように、注射後数分以内に、モルフォエンドポーター溶液は、少なくとも12時間以上にわたって血管系全体にフィンフォールドや脳などのさまざまな組織に分布します。

遠位幼鰭構造の再生を評価するために、鰭襞の遠位先端と脊髄、遠位臍帯、ここでは見えない遠位臍帯筋、および直接注射では標的とすることが難しいが、連続心室注射後にモルフォを取り込むように見える色素細胞を切除した。このように、この手法は、個々に標的とすることが困難な組織へのモルフォの送達を比較的容易に促進し、再生フィン内の複数の組織における遺伝子機能を一度に評価することを可能にする。再生に関与する特定の遺伝子の重要性を解析するために、幼虫のヒレを部分的に切断し、モルフォを取り込んだすべての組織を切除します。

幼虫のヒレの折り目は、実証されているように、切断後数日以内にその構造を再生します。ここで、morphoは、再生に必要な遺伝子を標的とし、unin注入時に比べて再生応答を乱し、かつミスマッチなmorpho制御制御をその開発後に行う。この技術は、再生分野の研究者がゼブラフィッシュヒレの再生に関与する分子メカニズムを探求する道を開きました。