ロボロリーパインPtGen2 cDNAマイクロアレイの処理

このビデオは、ジョージア大学ウォネル林業・天然資源学部（Warnell School of Forestry and Natural Resources）の研究者によって制作されました。このトレーニングビデオの目的は、LOB lolly pine pt、gen two CDNAマイクロアレイの処理方法について、特にハイブリダイゼーション前後のアレイの洗浄と取り扱いに重点を置いて詳細に説明することです。概して、当研究室のプロトコルは、アレイのプリントを行ったゲノム研究機構（The Institute for Genomic Research, TIGR）およびヴァンダービルト大学マイクロアレイ共有リソース施設（Vanderbilt Microarray Shared Resource Facility, VMSR）で開発された手法に従っています。

信号品質の均一性と低バックグラウンドに関して最大の整合性を得るためには、PT Gen twoに対してより厳格な処理が必要であることが分かりました。最初のステップは予備洗浄です。スポッティングバッファーは非常に高い塩濃度であるため、この塩を除去するために予備洗浄が必要となります。

スライドを顕微鏡スライドキャリアに入れ、43°Cに予熱した0.2% SDS溶液に15〜20回激しく浸漬します。SDS溶液で洗浄した後、ピンセットを用いてスライドを慎重に取り出し、前ハイブリダイゼーションバッファーを入れたコッペランドジャーに移します。このバッファーは5X SSC、0.1% SDS、1% BSAを含み、同様に43°Cに加熱されています。

コープランドジャーをparfumで覆い、43 °Cのインキュベーター内で1時間置きます。前ハイブリダイゼーション後、スライドを顕微鏡スライドキャリアに移し、脱イオン水を5回交換しながら、各交換ごとに15〜20回浸漬させます。最後に、スライドをイソプロパノールに入れ、5〜6回浸漬させた後、Chip-M-Mate遠心機で遠心して乾燥させます。

遠心分離後、0.2ミクロンのフィルターを通した圧縮空気でスライドを吹き付けます。次に、同じく圧縮空気で洗浄したリフタースリップをスライドに重ね、小さなピペットチップを使用して、リフタースリップをスライド上の正しい位置に調整します。

リフタースリップを配置した後、ハイブリダイゼーションバッファーを加える前に、チャンバーの両端にある湿度ウェルに100 millimolar dihi, three atolを20 µL加えます。これで、ハイブリダイゼーションバッファーで再懸濁したターゲットcDNAを加える準備が整いました。ピペットチップをリフタースリップとスライドの端に合わせ、溶液をゆっくりとピペッティングします。

毛細管現象を利用してアレイに負荷することが、最も一貫性が高く、不要な気泡の混入を大幅に減少させることが分かりました。ターゲット物質をアレイに添加した後、ハイブリダイゼーションチャンバーを組み立て、アルミホイルで覆います。次に、ハイブリダイゼーションチャンバーを振盪水槽に入れ、通常14時間から16時間のオーバーナイトインキュベーションを行います。

ウォーターバスを48°Cに設定し、シェーカーを50 rpmに設定します。また、ハイブリダイゼーション溶液を添加してからすべてのポストハイブリダイゼーション洗浄に至るまで、光酸化を防ぐため、手順を弱光下で実施することが重要です。翌日、スライドをハイブリダイゼーションチャンバーから取り出し、53°Cに予熱した洗浄液1を含むコープランドジャーに入れます。

リフターが剥がれるまで、スライドをコープランド瓶の中に約1分間静置します。その後、ピンセットでスライドを慎重に取り出し、洗浄工程に進むため顕微鏡スライドキャリアに配置します。次に、同じく53°Cの洗浄液1が入った2つ目の容器に、スライドを15〜20回ほど激しく浸漬させます。その後、容器にパラフィルムで蓋をし、53°C、100 RPMに設定したインキュベーターシェーカーに入れます。

10分間のインキュベーションと洗浄液1による洗浄後、スライドを室温の洗浄液2が入った容器に15〜20回激しく浸漬させます。容器にパラフィルムで蓋をし、再度室温のシェイカーに置いて10分間インキュベートします。最後に、スライドを洗浄液2から取り出し、洗浄液3が入った容器に15〜20回激しく浸漬させます。

次に、スライドをパラフィルムで覆った第2の洗浄液3の容器に移し、再びシェーカーで10分間振とうします。最後の洗浄後、スライドを遠心分離して完全に乾燥させます。この操作を行うには、50 mLコニカルチューブに15 mL Falconキャップを入れ、そこにアレイのバーコード面を下にして配置します。

次に、チューブをスイングバケットローターを用いて室温、1500 RPMで遠心分離します。遠心分離後、スライドをアルミホイルで覆った別の50 milコニカルチューブに移します。その後、0.22 micronフィルターでろ過した窒素ガスでチューブ内をパージし、搬送またはスキャンまでの保存のためにキャップを締めます。

スキャンデータはPerkinElmer scan array 5, 000を用いて収集します。アレイ画像にグリッドを適用し、バイオディスカバリー社のイメージングソフトウェアスイートを用いて、未処理のスキャンデータの処理および初期データ解析を行います。次に、BRB array toolsを用いてスポットの信号強度データの正規化および統計解析を行います。BRB array toolsは、国立がん研究所（National Cancer Institute）からダウンロード可能な、堅牢でフリーに利用できるマイクロアレイ統計パッケージです。

その他の統計解析および遺伝子発現パターンの検索は、無料で利用可能なもう一つのウェブベース解析パッケージである遺伝子発現パターンおよび解析スイートJeep PPAsを用いて行います。ロブロイ松PT Gen twoマイクロアレイの処理方法に関するビデオをご視聴いただき、ありがとうございました。

このトレーニングビデオの内容および制作は、以下の方々が担当しました。