エレクトロスプレーイオン化質量分析法を用いて酵母Lipidomeの定量評価

このプロトコルでは、酵母脂質ドームの主要成分を迅速に分析することができます。まず酵母細胞を回収し、洗浄します。洗浄した細胞をクロロホルムとメタノールの1:2混合液に入れ、ガラスビーズを用いて溶解させます。

クロロホルムと水を加えることで2層に分離させます。有機相を回収して乾燥させ、脂質フィルムをクロロホルムに溶解し、質量分析に先立って保存します。抽出した脂質を、水酸化アンモニウムを含むクロロホルムとメタノールで希釈し、内部標準物質の混合液を添加します。

これで脂質溶液を質量分析計に直接注入できるようになりました。コンコルディア大学生物学部、Vladimir Teco研究室のSimon Borkです。本日は、質量分析法を用いて酵母脂質を定量する方法をご紹介します。

当研究室では、異なる増殖条件下における酵母脂質の変化を研究するためにこの手順を用いています。それでは始めましょう。まず、あらかじめ調製しておいた酵母ペレットの冷凍保存サンプルを1.6 millilitersの氷冷蒸留水で再懸濁し、その細胞懸濁液1.6 millilitersを高速ガラス遠心管に移します。

本手順全体を通して、抽出した脂質のすべての操作はガラスピペットまたはシリンジを用いて行うことに注意してください。プラスチック類は大きなバックグラウンド信号の原因となるため、クロロホルムと接触させる場合は、細胞懸濁液にクロロホルムとメタノールの混合液（比率1:2）6 mLおよびガラスビーズ0.8 mLをエッペンドルフチューブで量り取って加え、脂質抽出を開始します。クロロホルム、メタノール、および水懸濁酵母の比率が1:2:0.8に保たれていれば、正確な容量は重要ではありません。ボルテックスで撹拌します。

細胞懸濁液とガラスビーズを1分間ずつ2回混合し、続いて2 mLのクロロホルムを加えて穏やかに混合した後、室温で時々混ぜながら5分間インキュベートします。5分間のインキュベーション後、2 mLの蒸留水を加えて穏やかに混合します。その後、再び室温で時々混ぜながら5分間インキュベートします。

ここでも、特定の容量よりも、クロロホルム、メタノール、水の比率を2:2:1.8に維持することの方が重要です。2回目のインキュベーションが完了したら、室温で3000 Gsにて5分間遠心分離し、この1回目の抽出で得られた上清をすべて新しい高速用ガラス遠心管に回収します。その後、残った細胞ペレットに3.2 millilitersのクロロホルムを加え、2回目の脂質抽出を行います。

クロロホルムを添加した細胞ペレットを、1回1分間、計2回ボルテックスします。その後、3000 Gsで5分間遠心分離します。室温にて、この2回目の抽出で得られた上清を、1回目の抽出後に回収した上清に加えます。次に、回収した上清を5分間遠心分離します。

室温で3000 Gsで遠心分離すると、抽出された脂質が下層の有機相に溶解します。上層の水相を廃棄し、下層を新しい高速用ガラス遠心管に移します。質量分析計でよりクリーンなスペクトルを得るために、有機相を室温で3000 Gsで5分間遠心分離し、上清をすべてガラスバイアルに移します。

溶解した脂質を窒素気流下で乾燥させ、乾燥した脂質フィルムを500 µLのクロロホルムで溶解し、質量分析によるサンプル分析まで-20 °Cで保存します。まず、添付の書面プロトコルの表1に記載されている、クロロホルム中の脂質標準混合液を調製します。各脂質は異なるクラスを表しています。

この溶液は、抽出した脂質を質量分析計に注入するまで、-20 °Cで保存することが可能です。サンプルの10 µLと、脂質の標準混合液10 µLを混合します。なお、標準物質とサンプルの比率は、必要に応じて変更してください。

1 µL/minの流速で動作するナノエレクトロスプレー源を備えたQ-TOF質量分析計を用いて、サンプルおよび標準脂質混合物を分析します。設定の詳細については、付属の書面プロトコルの表2に記載されています。Q-TOF質量分析計の高分解能を利用することは有利ですが、必須要件ではありません。

正確な装置パラメータは、質量分析計によって異なります。データ取得後、マススペクトルのスムージングを行い、バックグラウンド除去およびピークの中心合わせを行います。最後に、ピークリストをExcelにエクスポートします。

次に、各脂質クラスのピークを内部標準で正規化します。用途に応じて、脱アイソトープ処理やデコンボリューションなどのさらなる後処理が必要になる場合があります。本手法により、酵母脂質プロファイルの主要成分を迅速かつ詳細に決定することが可能です。

ここでは、アイソトープのデコンボリューションを行い、内部標準物質で正規化した1つの脂質について説明しました。これまでに、酵母脂質の単離方法と、エレクトロスプレーイオン化質量分析法を用いて酵母脂質を決定する方法について解説してきました。この手順を行う際は、プラスチックの使用を避け、サンプルが濃度の線形範囲内に収まるようにすることが重要です。

この手法は非常に柔軟であり、多くの容量は必要に応じて変更可能です。また、この抽出プロトコルは、薄層クロマトグラフィーや多次元質量分析などの他の脂質分析法にも適しています。以上で完了です。

ご視聴ありがとうございました。実験の成功をお祈りいたします。