質量分析法とあいまってペプチドイムノエンリッチメントを使用したタンパク質の定量化

本手順の全体的な目的は、それぞれのタンパク質のサロゲートとして機能するペプチドを、複雑な混合物の中から単離し定量することである。まず、混合物中の大きなタンパク質を、trypsinなどの酵素を用いて構成ペプチドに消化する。次に、標的となるペプチド分析物と、スパイク添加した安定同位体標識内部標準を、単離後にプロテインGコード磁性粒子に固定化した抗ペプチド抗体を用いて濃縮する。

標的ペプチドを磁性粒子から溶出させ、内部標準物質に対する定量のために質量分析で分析します。従来の免疫測定法などの既存の手法に対するこの技術の主な利点は、多数のアッセイを構築する際に、より迅速で費用対効果が高いことです。成功率が高く、容易にマルチプレックス化が可能であるため、本手順でその方法を詳しく説明します。

ラボの技術者が、氷上の10 µLの血漿アリコートを用意します。サンプルを1000 µLディープウェルプレートに移し、パラフィルムで密閉します。各サンプルに20 µLの新鮮な9 M尿素および30 mM DTTを加え、37 °Cで30分間インキュベートしてタンパク質を変性させます。次に、各サンプルに3 µLの新鮮な500 mMヨードアセトアミドを加え、室温の暗所で30分間インキュベートします。その後、100 mM Tris (pH 8)を用いて尿素濃度を0.6 Mに希釈し、酵素対基質比を1:50とするため、1 µg/µLのトリプシンストック溶液を10 µL添加します。

純粋なギ酸を3 µL添加して最終濃度1%とし、37 °Cで一晩反応させた後、安定同位体標準物質または複数の標準物質を添加し続けます。マルチプレックスアッセイを行う場合は、Oasisカートリッジプレートを0.1%ギ酸含有80%アセトニトリル500 µLで十分に洗浄し、ろ液を廃棄します。次に、0.1%ギ酸水溶液500 µLを添加してカートリッジプレートを平衡化し、ろ液を廃棄します。

ダイジェストサンプルをカートリッジプレートにロードし、流量が非常に遅くなるように真空度を調整します。水で調製した0.1%ギ酸を500 µL使用して3回洗浄し、通り抜けた液を廃棄します。80%アセトニトリル中の0.1%ギ酸を500 µL使用してペプチドを2回溶出させ、その後、溶出液を凍結乾燥またはスピードバックで乾固させ、乾燥したペプチドを0.03% CHAPSを含むPBS 50 µLで再構成します。サンプルを標準的なKingFisher 96ウェルプレートに移し、標的ごとに1 µgの抗体と1.5 µLのProtein Gコート磁性ビーズを加えます。ビーズは添加前にボルテックスで撹拌してください。

ビーズが十分に懸濁していることを確認してください。プレートをアルミホイルで覆い、緩やかなタンブリング遠心機を用いて一晩インキュベートします。プレートを400 RPMで10秒間遠心し、ホイル表面の液体を取り除きます。

ホイルカバーを取り除きます。サンプルの操作は、自動化されたKingfisherプラットフォーム上で行います。ビーズを200 µLのPBS（0.03% CHAPS含有）で2回洗浄し、次いでPBS（0.03% CHAPS含有）の10倍希釈液200 µLで1回洗浄します。その後、25 µLの5% 酢酸（0.03% CHAPS含有）を用いてペプチドを溶出させます。

溶出プレートをマグネットに載せ、残ったビーズが混入しないように注意しながら、溶出液を96ウェルプレートに移します。プレートをシーリングマットで覆い、溶出液の入ったこのプレートをトリプル四重極質量分析計にかけ、分析を行います。MRM法は、目的のペプチドのタンデム質量スペクトルを取得し、最適な遷移フラグメントイオンを選択および最適化することで構築します。

通常、MRM分析の構成では、C 18トラップカラムおよび分析カラムと2種類の移動相を使用します。サンプルを10 µLロードし、線形グラジエントにより溶出させます。ライトペプチドとヘビーペプチドのピーク面積を積分し、各サンプルにおける非標識ペプチドと標識ペプチドのピーク面積比を算出します。

ライトペプチドとヘビーペプチドは同時に溶出し、各ペプチドについて複数のトランジションをモニタリングできます。同定を確認するため、内標準の面積に対する内因性ペプチドのピーク面積を測定し、標的ペプチドの定量的な値を算出します。このビデオを視聴することで、この手法を研究室でどのように導入すべきかについて十分な理解が得られるはずです。この手法は任意の目的タンパク質の定量に使用できるため、生物学的研究における幅広いアプリケーションに適しています。