アッセイをストレッチ単一分子のDNAを用いて酵素の複製DNAの直接観察

このビデオでは、広視野光学顕微鏡を用いて、線状化し化学修飾を施したλ DNAの複製を可視化するプロトコルを紹介します。DNAは機能化されたガラスカバースリップに固定されます。DNAの自由端にはビーズで標識がなされ、層流によってDNAが伸展されます。

複製が開始されると、リーディングストランドが伸長し始める一方で、ラギングストランドは巻き戻しによって短くなります。低荷重条件下では、二本鎖DNAと一本鎖DNAの長さに大きな差があるため、複製中のDNA転換を直接観察することが可能です。ビーズの位置を追跡することでDNA構築物の長さをモニタリングし、これによりDNA複製の速度とプロセスを精密に決定することができます。

こんにちは。ハーバード大学医学部、生物化学・分子薬理学部のAnto one VanianおよびCharles Richardsonの研究室のAri Ulrichです。本日は、単一分子レベルでDNA複製をイメージングする手順をご紹介します。私たちの研究室では、DNA合成中に起こる酵素活性を研究するためにこの手法を用いています。

それでは始めましょう。この手順の最初では、線状化したバクテリアファージLambda DNAを、アニーリングさせるオリゴヌクレオチドによって修飾し、複製フォーク、lambda相補的フォークアーム、ビオチン化フォークアーム、およびフォークプライマーを形成させます。ビオチン化フォークアームの5'末端にはビオチンが結合しており、これによりDNAテンプレートをフローセルの表面に固定することが可能になります。

λ DNAは、ビーズへの結合のための高親和性免疫タグとして機能するdiggenin部位を含む別のオリゴヌクレオチドをアニーリングさせることで、さらに修飾されます。複製フォークを生成するには、λ DNAに加えて、本ビデオに付随する書面プロトコルに記載されている配列を持ついくつかのオリゴヌクレオチドを用意します。これらのオリゴヌクレオチドには、ビオチン化したフォークアーム、λ相補的フォークアーム、フォークプライマー、およびλ相補的diggenin末端が含まれます。T4ポリヌクレオチドキナーゼを用いて、λ相補的フォークアームおよびλ相補的diggenin末端の5'末端をリン酸化します。

次に、リン酸化したλ相補的フォークアーム、ビオチン化フォークアーム、フォークプライマー、およびλDNAを、モル比10:10:100:1で混合します。T4 DNA Ligase buffer中で、混合液を65 °Cで5分間加熱し、ヒートブロックの電源を切ることで室温までゆっくりと冷却し、オリゴヌクレオチドとT4 DNA ligaseを混合液に適切にアニーリングさせ、2時間インキュベートします。室温において、T4 DNA LigaseがオリゴヌクレオチドとλDNAの間のニックの封鎖を触媒します。

DNAを最終的にアニリングさせ、リン酸化されたlambda補完的diggen末端をT4リガーゼバッファー中でDNA複製テンプレートに添加します。混合液を45°Cで30分間インキュベートし、その後、ヒートブロックの電源を切ることでゆっくりと室温まで冷却します。混合液にT4 DNAリガーゼを添加し、室温で2時間インキュベートして、リン酸化されたlambda補完的dig oxygen末端をDNA複製テンプレートにライゲートします。これで最終的なDNA複製テンプレートが完成し、使用可能な状態になります。タッセリ化された活性化磁気ビーズをDNA複製テンプレートに結合させるためには、digogenに特異的なFABフラグメントで機能化する必要があります。

この工程を開始するために、ビーズのストック溶液を再懸濁し、400 µLをエッペンドルフチューブに移します。チューブを磁気セパレーターに設置し、溶液が透明になるまで静置します。その後、ピペッティングによって上澄みを除去します。抗体結合のためにトリアルグループを活性化させるには、1 mLの結合バッファーを加え、ピペッティングで緩やかに混ぜ合わせます。

再度、磁気セパレーターを用いて上清を除去します。次に、240 µLのFAB断片を加え、400 µLのホウ酸緩衝液でビーズを再懸濁します。十分に混合し、ローテーターを用いて37 °Cで16から24時間インキュベートします。

インキュベーション後、磁気分離装置を用いてビーズを分離し、上清を除去します。洗浄バッファー1 mLでビーズを洗浄し、4 °Cで5分間インキュベートした後、磁気分離装置を用いてバッファーを除去します。この洗浄操作を2回繰り返します。

遊離したトシル基をブロックするため、Tris緩衝液を含むBSAを1 mL加え、37 °Cで4時間インキュベートします。インキュベート後、磁気セパレーターを用いてビーズから緩衝液を除去し、緩衝液で2回洗浄して分注します。使用にあたり、複製対象となるDNAをアミランで機能化されたガラスカバースリップに結合させます。

Amil laneのオキシ基がガラスに結合し、アミン基がビオチン化PEG分子との結合に利用可能な状態で残ります。このコーティングにより、表面への非特異的結合を低減させることができます。ガラスカバースリップを完全に洗浄するため、染色瓶に入れ、エタノールを満たして超音波洗浄を行います。

30分間、ジャーをすすぎ、1 M 水酸化カリウムを満たして30分間ソニケーションを行い、これらの洗浄を2回繰り返します。最初の機能化反応では、すべての水分を取り除く必要があります。ステイニングジャーにアセトンを満たし、10分間ソニケーションを行います。

ジャーを空にして、再びアセトンを満たします。次に、サイン試薬をジャーに加え、2分間撹拌します。その後、大量の水でクエンチします。

次に、カバーガラスをオーブンで110 °Cで30分間焼成して乾燥させます。続いて、約0.2% w/vのPEG混合液を調製します。ガラスカバーガラススペーサーを含むビオチン化PEGはカバーガラスの分離を可能にするため、乾燥したシリコン化カバーガラス上に100 µLをピペットで滴下します。

2枚目のカバーガラスを上に重ねます。カバーガラスをPEG溶液中で3時間インキュベートします。その後、カバーガラスのペアをそれぞれ分離し、水で十分に洗浄します。

カバーガラスの機能化された面を上にすることに注意してください。PEGでコーティングされるのは片面のみであるためです。最後に、圧縮空気でカバーガラスを乾燥させ、真空状態で保存します。デシケーター内であれば、表面は少なくとも1ヶ月間安定して保持されます。したがって、一度に数十枚のカバーガラスを作製し、必要に応じて使用することが可能です。

カバーガラスの準備が整ったので、単分子実験用のフローチャンバーを組み立てます。単分子実験は、機能化されたカバーガラス、両面テープ、石英スライド、およびチューブを用いて構築したシンプルなフローチャンバーを使用して行われます。単分子実験ごとに1つのフローチャンバーを準備します。

まず、5 mLのブロッキングバッファーと20 mLのワーキングバッファーを混合し、後の工程に向けて気泡を除去するため、混合液をデシケーターに入れます。次に、PBSで調製したstrp dinワーキングソリューション100 µLをPEG修飾カバースリップの表面に広げ、strp dinが表面のビオチンに結合するように、室温で20分間インキュベートします。その間に、石英スライドのサイズに合わせて両面テープを切り、テープ上にチューブ穴の位置をマークします。

幅3 mmの中心チャネルと、両方の穴を含む長方形を描き、フローチャンバーの輪郭を概説します。フローチャンバーは、2つの流入路と2つの流出路を持つY字型チャネルで設計できます。次に、描いた輪郭に沿ってマークしたテープを切り出し、接着剤がチャネル内に突き出さないよう、直線的にきれいにカットします。

アセトンを用いて石英スライドを十分に洗浄し、以前の実験でのフローセル構築に使用した接着剤を除去します。チャネルの外形が最適に配置される位置を確認します。粘着テープの片面の剥離紙を剥がし、石英スライドの上に慎重に貼り付けます。

流入孔と流出孔が塞がれないよう、テープを適切に配置することに注意してください。次に、フローセルの流入側および流出側に使用する内径0.76 millimeterのチューブを適切な長さにカットして準備します。チューブの端を約30度の角度でカットすることで、チューブがチャンバーの底に密着して潰れるのを防ぎます。

次ステップでフローセルに簡単に接続できるよう、チューブを試験管ラックに吊り下げておきます。この時点で、カバーガラスのインキュベーションが完了しているはずです。カバーガラスを水で十分に洗浄し、圧縮空気を用いて乾燥させます。

カバーガラスの片面のみがPEGで機能化されているため、裏返さないように注意してください。テープの裏面のもう一方を剥がし、石英スライドをカバーガラスの上に配置して、フローチャンバーの組み立てを完了させます。カバーガラスを軽く押し、接着剤に閉じ込められた空気を押し出してください。これにより、フローチャネル内に気泡が混入するのを防ぐことができます。

エポキシ樹脂でチャンバーの側面を密封します。カットしたチューブを石英の穴に挿入し、エポキシ樹脂で固定して密封します。数分間乾燥させます。

乾燥後、21ゲージの針を用いてDGAsブロッキングバッファーをチューブの一つから注入し、チャンバー表面をブロッキングします。気泡を取り除くために数回フラッシュし、単一分子複製実験に移る前にチャンバーを少なくとも30分間インキュベートしてください。DNAテンプレート機能化ビーズとフローチャンバーの準備が整えば、単一分子実験を行うことができます。

まず、フローセルを顕微鏡ステージ上に設置します。ステージクリップでチャンバーを固定し、フローチャンネルがCCDカメラと一直線になるように配置してください。あらかじめ作製しておいたエアスプリングを、シリンジポンプとフローセルの流出チューブに接続します。

より大径のコネクターチューブを用い、フローセルの入口チューブをブロッキングバッファーに浸し、シリンジを引いてチューブ内から気泡を除去します。次に、出口チューブを軽く弾き、フローセル内に閉じ込められた気泡を取り除きます。すべての気泡が除去されたら、入口チューブの一方を針で塞ぎ、出口チューブの一方を180度に折り曲げて粘着テープで固定して密閉します。セルにDNAを添加する前に、ストックのDNAテンプレートを1 mLのDGAs 1xブロッキングバッファーで10 pMに希釈します。DNAが表面を十分に覆うよう、適度な流速でテンプレートをチャンバー内に流します。

ストックビーズ溶液を、1 mLあたり2〜4 × 10⁶個のビーズになるように、1x DGAsブロッキングバッファー 1 mLで希釈します。次に、混合液をボルテックスし、20秒間超音波処理します。

希釈したビーズ溶液をチャンバーに流します。ビーズの添加が完了したら、フローを停止し、チャンバー内が平衡状態に達するまで待ちます。その後、両方の出口チューブを閉じます。

チャンバーを閉じた状態でチューブに変更を加えない場合、圧力変動が生じ、ビーズに強い力がかかってテザリングされたDNA分子がせん断されます。ビーズの充填に使用したインレットチューブを、2本目のインレットチューブを用いて針で塞ぎます。ブロッキングバッファー洗浄液の1倍溶液を用いて、フローセルを十分に洗浄します。

ステージを軽く叩いて振動させ、表面に非特異的に付着しているビーズを除去し、確認してください。ビーズはDNAに係留されています。フローの方向を変更して試みてください。

遊離したビーズが十分に除去されたら、フローを停止し、チャンバー内を平衡状態にします。テキストプロトコルに従い、複製タンパク質を含む新鮮な反応混合液を調製します。開いている流出チューブを閉じ、流入リザーバーを、新しく調製した反応混合液に切り替えます。

酵素反応を進行させるため、急激な圧力変化を避けるようにアウトレットをゆっくりと開きます。まず、タンパク質溶液を適度な流速でチャンバー内に流し、DNAへの効率的な結合を促します。その後、フローを停止し、チャンバー内が平衡状態に達するまで待ちます。

流出口チューブを閉じ、反応混合物を含むチューブを交換します。DGAs洗浄バッファーが入ったチューブを用いて、洗浄後に遊離タンパク質を除去するためにチャンバーを洗浄します。再びフローを停止し、チャンバーが平衡状態に達するまで待ちます。

出口チューブを閉じ、洗浄バッファーの入ったチューブを交換します。T7複製バッファーを含むチューブを使用します。T7複製バッファーには、複製反応の開始を誘発する塩化マグネシウムが含まれています。本プロトコルに記載された条件において、DNAテザーに3 pNの抗力（drag force）が加わる流速0.012 mL/minを使用してください。

ビーズと表面の間の非特異的な相互作用を防ぐため、イメージングの前にフローセルの上に希土類永久磁石を配置します。10倍対物レンズとCCDカメラを用いた顕微鏡視野の近くに、入射角10度から顕微鏡ステージと平行の間でファイバー照明を設置します。テザービーズを用いてビーズイメージングの焦点におけるコントラストを高めるため、暗視野照明を使用します。

低フレームレートで20〜30分間、データ収集を開始します。実験が成功すれば、100個のビーズを同時に観察できます。この実験により、リーディング鎖のDNA合成を示す多数のトレースが得られるはずです。

DNAの巻き戻りと重合の速度およびプロセッシビティを測定するためには、ビーズの正確な位置を決定する必要があります。これらの位置を二次元ガウス関数でフィッティングしてください。トラッキングソフトウェアを用いて各フレームのビーズ位置を追跡し、軌跡を可視化します。

次に、グラフィックソフトウェアを用いてビーズの位置を時間の関数としてプロットし、速度データを取得します。プロットに線形回帰を適合させ、プロセッシビティの傾きを算出します。短縮イベントの開始から終了までのDNAの全長を決定します。

すべての単一測定値をまとめ、速度および生産性の分布をプロットし、それぞれガウス関数および単一指数関数を用いてデータにフィッティングさせます。以上で、単一分子レベルでDNA複製の速度とプロセッシビティを測定する方法を説明しました。この手順を行う際は、層流による力や特定の負荷が、複製タンパク質の酵素活性に影響を与えないようにすることが重要です。

以上となります。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験が実りあるものとなることを願っております。