HIVとライブ共焦点顕微鏡の蛍光クローンを使用して、HIVの可視化細胞間伝達

本手順では、HIVを発現するジャージー猫T細胞と非感染の一次T細胞との間のウイルス学的シナプスを介した、GFP標識HIVの移行をライブセルイメージングを用いて可視化します。細胞間移行アッセイは、まずHIV-1の感染性蛍光クローンであるHIV gag-GFPでジャージー猫T細胞をトランスフェクトし、HIV gag-GFPを発現させたジャージー猫細胞を調製することから始まります。次に、これらの細胞をCMTMR標識した非感染一次T細胞と混合し、イメージングチャンバーにロードして、ウイルス学的シナプスを介したGFP標識HIVの移行を観察します。

得られたデータは画像解析ソフトウェアを用いて分析し、T細胞のウイルス学的シナプスを介したHIV転移の詳細を明らかにします。こんにちは、私はマウントサイナイ医科大学医学部のBen Chen研究室のBenjamin Daleです。私はUC DavisメディカルセンターのNSFバイオフォトニクスセンターにあるThomas Huser博士の研究室のGreg McNerneyです。

私はDeanna Thompsonで、同じくDr.Thomas Huserの研究室に所属しています。本日は、生細胞共焦点顕微鏡を用いてHIV-1の細胞間移行を可視化する手順をご紹介します。この手順では、Jurkat細胞にHIV-1の感染性分子クローンをトランスフェクションします。本操作は、認証済みのバイオセーフティー施設で勤務する、訓練を受けた専門職員のみが行ってください。

本プロトコルは、バイオセーフティーレベル2（BSL-2+）またはレベル3（BSL-3）の組織培養室で実施可能です。イメージング施設で感染性HIVを取り扱う場合は、所属機関のバイオセーフティー委員会の承認を得る必要があります。ドナー細胞として使用するjerk cat cellsは、2×10⁵～8×10⁵ cells/mLの濃度で維持してください。

jerk cat細胞の培養において、培地中の細胞濃度が8×10⁵ cells/mLを超えると、導入効率が低下します。手順を開始するには、付属の書面プロトコルに記載されているamax nucleo affection法を用いて、5×10⁶個のjerk cat細胞にウイルスプラスミドHIV gag IGFPを導入し、一晩細胞を回復させてください。末梢血単核細胞は、ヒト全血のバフィーコートからFICO密度勾配遠心法により精製されます。

CD4陽性T細胞分離キットを用いたネガティブセレクションにより、末梢血単核細胞から一次CD4陽性T細胞を精製します。ネガティブセレクションされたCD4陽性T細胞を磁気カラムから回収し、10 units/mLの組換えヒトIL-2を添加した10% FPS含有PMIで培養します。また、単離した一次CD4陽性T細胞を分注し、凍結保存容器を用いて凍結保存することも可能です。凍結保存容器は、-70 °Cのフリーザーに最低3〜4時間置きます。

その後、細胞を液体窒素に移し、長期保存します。Jurkat細胞のトランスフェクションと、標的となる一次CD4陽性T細胞の分離が完了しましたので、トランスフェクションの翌日に細胞の洗浄およびラベル化に進みます。これにより、Jurkat細胞で感染性蛍光HIVコンストラクトが発現します。

感染性サンプルを取り扱う際は、前開きのラボコートを着用し、手袋を2重に装着します。Ficoll高密度勾配 mediumを用いた遠心分離により、トランスフェクションした細胞から細胞残渣を除去します。まず、15 mLコニカルチューブの底にFicoll Packを1.5 mL分注します。

次に、5 mLのPMI培地を用いたトランスフェクション済みのjerk hat細胞で、グラジエント物質を静かに覆います。この時点で、トランスフェクション済みのjerk hat細胞は感染性HIVを産生できる状態にあります。したがって、HIV発現細胞に接触したすべてのピペットチップは、10%次亜塩素酸ナトリウム溶液で消毒しなければなりません。

バイオセーフティキャビネット内の容器に廃棄する前に、チューブにキャップをし、チューブの外側を70% ethanol溶液でスプレーし、乾いたキムワイプで拭き取ります。細胞を室温で、ブレーキをオフにした状態で400 Gs、20分間遠心分離します。遠心分離後、ピペットを用いて培地と細胞の界面から細胞を注意深く回収し、新しい15 milliliterコニカルチューブに移します。細胞をPMI mediumで希釈して全量を15 millilitersにし、300 GSで10分間遠心分離します。

室温にて、ペレットを3 mLのJurkat培養培地に懸濁し、6ウェルプレートの2 cmウェルに移します。翌日の使用準備が整うまで、プレートを組織培養インキュベーターに入れておきます。同日の夜に、ターゲット細胞として使用する一次CD4陽性T細胞を、ドナー細胞と区別するためにラベル付けします。まず、6種類の一次CD4陽性T細胞から4×10⁶個を、400 ×gで10分間遠心分離してペレット化します。

次に、細胞を5 mLのPBSで洗浄し、2 mLのPBSに再懸濁します。CellTracker Orangeを最終濃度1.5 µMになるように加え、37 °Cで数分間インキュベートします。インキュベーション終了後、8 mLの完全CHIK mediaを加え、400 ×gで10分間遠心分離します。

10 units/mLのIL-2を添加した3mLの完全培地で細胞を再懸濁し、組織培養インキュベーターで一晩培養します。一晩の培養後、ドナー細胞およびターゲット細胞が細胞間転移実験に使用可能な状態になります。細胞間転移実験を開始する前に、室内の温度変動からプラットフォームを保護するため、イメージングチャンバーを準備します。

また、室内の背景光を遮断するため、顕微鏡の加熱セットアップ全体に大きな黒色のシュラウドを被せ、システム周囲に断熱空気層を形成します。イメージングチャンバーは、サンプルに隣接して配置したT型熱電対チップによる温度フィードバックを備えた恒温ヒーターを用いて、37 °C の安定した温度に維持します。サンプルの装着前に30分間予熱してください。

倒立光学顕微鏡を用いたスピニングディスク共焦点イメージングにより、HIVの細胞間伝播の3D共焦点画像を構築します。Zステージを含むすべてのハードウェアおよびデータ取得は、IQ version 1.8ソフトウェアによって制御されます。スキャンはCS U 10スピニングディスク共焦点ユニットによって行われ、800以上の共焦点スポットを同時に使用することでスキャン速度を劇的に向上させ、その高速性を補完しています。CS U 10は高感度の電子増倍CCDカメラと組み合わされており、低光量での高速イメージングを可能にし、光退色と光毒性の両方を低減させています。

蛍光光源には、多波長アルゴンクリプトンイオンガスレーザーを使用します。目的の波長（ここでは488 nanometersおよび568 nanometers）を選択し、出力を制御して光退色をさらに抑制し、イメージング時間を延長するために、アコーストオプティック可変フィルター（AOTF）を使用します。AOTFは、カメラが画像をキャプチャしていない15 to 30 millisecondの各露光後にレーザーを迅速にシャッターし、EMCCDカメラからコンピュータへ画像が転送される間の不要な露光を回避します。

レーザー光は、405/488/568/647 nmのクアッドバンドダイクロイックミラーを用いて回転ディスクシステムに導入されます。蛍光放出は、イメージスプリッターを備えた560 nmロングパスダイクロイックミラーにより波長ごとに分離されます。グリーンチャンネルは525/50 nmバンドパスフィルターで、レッドチャンネルは609/54 nmバンドパスフィルターでフィルタリングされます。これら2つのチャンネルは、EMCCDカメラ上に並べて投影されます。

イメージングチャンバーのウォームアップ中に、細胞間転移実験のための細胞準備を行います。ヘモサイトメーターを用いて、HIV gag IGFPを発現するette細胞をカウントしてください。ウイルス発現細胞に直接さらされるのを避けるため、ヘモサイトメーターをペトリ皿の中に置いて使用します。

細胞を二酸化炭素独立培地で洗浄し、1〜3 × 10⁷ cells/mLの濃度になるようにライブセルイメージング培地で再懸濁します。二酸化炭素独立培地を使用することで、イメージング時に二酸化炭素環境チャンバーを使用する必要がなくなります。

同様に、標識した一次CD4陽性T細胞を計数し、洗浄して再懸濁します。次に、細胞間転移を開始するため、HIV gag IGFPをトランスフェクトしたJurkat細胞 20 µLと、標識した一次CD4陽性T細胞 40 µLを混合し、組織培養処理済みのガス透過性EBDマイクロチャンバーに 50 µLをロードします。チャンバーをプラグで密封し、プラグとEBDチャンバーの接合部をパラフィルムで巻いて固定します。

70% ethanolを浸した化学ワイプでイメージングチャンバーを拭き、フード内で短時間、自然乾燥させます。不慮の曝露を避けるため、密閉したイメージングチャンバーを密閉容器に入れて運搬します。IBDイメージングチャンバーに細胞をロードした直後に、運搬中にチャンバーを落とした場合は、直ちにデバイスを顕微鏡に取り付けてください。

60倍 1.42 NAの油浸対物レンズを使用して、細胞ペアの画像を撮影します。高開口数により分解能が大幅に向上するため、3D画像スタックあたりの取得速度を最大化できます。EM CDカメラの記録領域を、細胞ペアの直近の領域までクロップしてください。さらに、これらの条件下では、0.45 µmから0.75 µmの大きなZステップを設定することで、取得速度をさらに向上させることができます。

画像は20分から60分の間隔で連続的に記録されます。同一のサンプルスポットを繰り返しイメージングする場合、取得時の光退色が最小限であれば、最大6時間まで延長可能です。各データセグメントは数万枚の画像で構成されており、合計で5～20ギガバイトの容量を占めることがあります。

大容量ファイルの転送と解析を容易にするため、各ファイルは分割され、1 GBのTIFF画像ファイルセグメントとしてエクスポートされます。取得した画像を解析するには、いくつかの画像解析ソフトウェアプログラムのいずれかを使用してください。強度退色補正（intensity bleach correction）や、gag punctaの自動および手動トラッキングを含む画像解析の詳細については、付属の書面プロトコルを参照してください。

混合後10〜15分以内に、HIV gag IGFPを発現したジャークキャット細胞が一次CD4陽性T細胞に接着する様子を可視化できます。これらの接合体を用いて、感染細胞および標的細胞におけるgag punctaの動きを評価することが可能です。シナプス形成後30分から3時間以内に、CellTrackerでラベル化された標的細胞内へgag IGFP punctaが移動する様子が観察されます。

T細胞間におけるHIVの細胞間移行を視覚化する方法について説明しました。これらの手順を行う際は、HIV発現細胞に曝露したサンプルを取り扱う際、バイオセーフティーレベル2+またはバイオセーフティーレベル3のすべての予防措置を遵守することが非常に重要です。また、トランスフェクションを最適化するために、適切に維持されたJCA細胞とエンドトキシンフリーDNAを使用することを忘れないでください。

以上です。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りいたします。