ウイルスの核酸とタンパク質を視覚化し、HIV、HTLV、HBV、HCV、ジカウイルス、インフルエンザ感染を監視するためのシングルセルマルチプレックス蛍光イメージング

DNA、RNA、およびタンパク質のマルチプレックス免疫蛍光細胞ベースの検出アプローチにより、単一細胞内の異なるタイプと鎖状のタンパク質と核酸を同時に視覚化できます。播種する前に、カバースリップをエタノールで5分間インキュベートし、続いてPBSで2分間の洗浄を2回行います。2回目の洗浄後、カバースリップをポリD-リジン1ミリリットルあたり20マイクログラムに室温で30分間完全に沈めました。

インキュベーションの終了時に、PBSで2回の洗浄で過剰なマトリックス溶液を除去し、目的の細胞をカバースリップ濃度あたりPBSの50マイクロリットルあたり6番目の細胞まで1 x 10で希釈します。次に、目的の細胞の50マイクロリットルを各ポリD-リジンコーティングカバースリップに播種し、室温で30分間インキュベーションします。インキュベーションの終了時に、細胞をPBSで3回洗浄してから、4%パラホルムアルデヒドに30分間固定します。

インキュベーションの終了時に、PBSで細胞を2回洗浄してから、PBSで500マイクロリットルの0.1%Tween 20を室温で10分間浸透させます。インキュベーションの終わりに、各カバースリップを500マイクロリットルの新鮮なPBSで2回洗浄します。カバースリップをスライドガラスに固定するには、滅菌したスライドガラスに透明なマニキュアを少量垂らし、カバースリップのセルフリー側の一端をマニキュアのドロップに置き、カバースリップを上向きのスライドセル側に下げます。

固定化されたカバースリップにPBSを数滴加えて細胞の脱水を防ぎ、疎水性バリアペンを使用してカバースリップの外側に円を描きます。バリアが引かれたら、PBSを100マイクロリットルのプロテアーゼIIIと交換し、スライドを摂氏40度のインキュベーターに15分間置きます。.インキュベーションの終わりに、スライドを新鮮なPBSで2回、ロッキングしながら1回の洗浄につき2分間洗浄します。

2回目の洗浄後、目的のプローブを200マイクロリットルのハイブリダイゼーションバッファーで摂氏67度で10分間希釈します。インキュベーションの終了時に、各カバースリップに50マイクロリットルのプローブ溶液を加え、スライドを加湿した摂氏40度のオーブンに2時間入れます。インキュベーションの終わりに、スライドを新鮮な洗浄バッファーで2回洗浄し、洗浄ごとに2分間揺さぶります。

2回目の洗浄後、スライドを軽くたたいて余分なバッファーを取り除き、蛍光チャンネル1、2、および3のアンプ1、2、および3のアンプ1滴でカバースリップを順次処理し、アンプごとに30分間、摂氏40度のインキュベーションを行い、処理と処理の間に洗浄ごとにロッキングしながら新鮮な洗浄バッファーで2分間の洗浄を行います。最後の洗浄後、40°Cのオーブンで15分間インキュベーションするために、カバースリップに蛍光チャンネル4アンプを一滴加え、スライドを洗浄バッファーで2回、PBSで1回洗浄します。目的のタンパク質の免疫染色には、最後の洗浄後、各カバースリップを200マイクロリットルのブロッキングバッファーで室温で1時間のインキュベーションで処理します。

インキュベーションの終了時に、ブロッキングバッファーをデカントし、PBSで希釈した目的の一次抗体200マイクロリットルと、1%ウシ血清アルブミンを添加したTween 20を加えます。室温で1時間のインキュベーションを行った後、スライドを新鮮なPBSとTween 20で10分間の洗浄を2回行い、洗浄ごとに振とうを行い、その後、適切な二次抗体でサンプルを室温で1時間標識します。インキュベーションの最後に、スライドを新鮮なPBSとTween 20で10分間2回洗浄し、1回の洗浄ごとに振動します。

2回目の洗浄後、適切な核色素で核を室温で1分間対比染色し、続いてPBSで室温で10分間振とうしながら2回洗浄します。イメージング用のサンプルをマウントするには、サンプルごとに1つの新しい滅菌スライドガラスに1滴の退色防止溶液を置き、カバースリップとほぼ同じサイズの領域をカバーするように溶液を広げます。カバースリップをスライドから取り外し、カバースリップをPBSに沈めます。

鉗子を使用して残っているマニキュアを取り除き、カバースリップの裏側をラボワイプで乾かします。次に、各カバースリップサンプルを下にして色あせ防止溶液にそっと置き、サンプルを一晩乾燥させます。この手順の概念実証として、HIV-1 DNA、RNA、およびタンパク質を同時に標識し、単一細胞レベルで顕微鏡的に視覚化しました。

この例では、2つのHIV-1、DNAゲノムがウイルスRNAを活発に転写しているため、1つの細胞内で視覚化できます。ウイルスRNAは核孔複合体を介して輸送され、ウイルスタンパク質は細胞質で合成されました。観察されたように、プローブ交差反応性の可能性のある2つのレトロウイルスで標識しているにもかかわらず、2つのウイルスにわたるプローブセット間で交差反応性はほとんどまたはまったく観察されません。

さらに、サンプル調製中に細胞をRNaseで処理すると、ウイルスRNAの染色を排除できます。その後、各画像内の細胞あたりの抗体シグナルの平均的な積分蛍光強度を定量化できます。観察されたように、HBVプレゲノムRNAおよび全HBV RNAの量は、HBV感染の過程で増加します。

HCV感染イメージングは、60倍油浸対物レンズを使用した共焦点顕微鏡で目的の蛍光色素を検出することもできます。この非常に特異的なアプローチにより、ウイルスまたは細胞のプロセスを高い空間時間分解能で追跡することもできます。さらに、この手法は、複数のウイルスやその他の病原体の研究にも使用できます。