自動プロテオーム処理のためのデジタルマイクロ流体

臨床プロテオミクスは、疾患の早期診断や予後予測に有用なバイオマーカーの発見が期待される重要な新領域です。本稿では、タンパク質抽出、再溶解、還元、アルキル化、および酵素消化を含む、臨床プロテオミクスで用いられる複数の処理工程を統合した新しいデジタルマイクロフルイディクス（DMF）法について報告します。DMFは、電極アレイ上の不連続なタンパク質試料マイクロドロップレットを利用し、室温で動作させることができるため、試料の自動並列解析が可能です。

この手法は従来の方法を大幅に改善したものであり、臨床プロテオミクスにおける有用な新しいツールとなる可能性があります。こんにちは、トロント大学化学科およびバイオマテリアル・バイオメディカル工学研究所のErin Wheeler教授の研究室に所属しているSteve Scheです。こんにちは、トロント大学のWheeler研究室のGabrielです。

私はヴィヴィアン・ルークです。トロント大学の Wheeler 研究室に所属しています。私はエリン・ホイラーです。スティーブ・メイスとヴィヴィアンと一緒に研究できることを幸運に思っています。

本日は、デジタルマイクロフルイディクスを用いたプロテオーム解析の処理手順をご紹介します。当研究室では、タンパク質や生物学的試料の研究にこの手順を用いています。それでは、始めていきましょう。

ドラフトチャンバー内で、ピラニア溶液を用いてガラス基板を洗浄し、手順を開始します。適切な保護具を着用してください。ピラニア溶液は、濃硫酸と30%過酸化水素を3:1の割合で混合して調製するため、取り扱いには十分注意してください。

ガラス基板をピラニア溶液に10分間浸漬し、洗浄後、脱イオン水でリンスし、窒素ガスで乾燥させます。基板を電子ビーム蒸着装置に入れ、クロムを250 nanometersの厚さに堆積させます。この厚さに達したら基板を装置から取り出し、イソプロパノールでリンスした後、ホットプレートを用いて115 degrees Celsiusで5分間乾燥させます。

ヘキサメチルジシラザン（HMDS）を用いて、30秒間のスピンコートで乾燥させた基材をプライミングします。同様のパラメータを用い、Shipley S 1811フォトレジストで3000 RPMにて再度スピンコートします。

基板をホットプレート上で100 °Cで数分間プリベークします。次に、フォトマスクを用いて、5秒間の紫外線（UV）照射によりフォトレジストをパターニングします。続いて、UV照射した基板をShipley MF 3 21現像液に浸し、3分間現像します。

基板をDIウォーターで洗浄します。ホットプレートを用いて100 °Cで1分間直接ベークします。基板が完全に浸る程度のクロムエッチング液に30秒間浸し、露出したクロムをエッチングします。

基材をDIウォーターで洗浄し、基材が完全に浸かる十分な量のZ 300 Tストリッパーに10分間浸します。これにより、残存しているフォトレジストを除去します。DIウォーターで洗浄し、窒素ガスで乾燥させます。

この堆積に続き、化学気相成長法を用いて2〜5 µmのParaline C絶縁ポリマーを基板上に堆積させます。次に、溶液のスピンコーティングにより、表面を疎水性にするため50 nmのTeflon AFを堆積させます。 fluorinert FC 40を用いた1% w/w溶液を、2000 RPMで60秒間、基板上に塗布します。

未処理の酸化インジウムスズ（ITO）ガラス基板を用いて、同様の手順でトッププレートを製作します。デジタルマイクロ流体デバイスを構築するため、両方の基板をホットプレート上で160 °Cで10分間加熱してください。

メスを用いて、下層基板のコンタクトパッドからポリマーコーティングを掻き取って除去します。下層基板の露出したパッドを40ピンコネクタで接続し、LabVIEWを実行しているコンピュータの電源を入れます。ここでは、dpadで制御される信号を備えたリレーを搭載した自作のコントロールボックスを使用します。

コンピュータ制御ボックスにより、40ピンコネクタを介して18 kHzの信号に対し100 V RMSをデバイスに印加する操作が可能になります。あわせて、関数発生器とアンプの電源を入れます。底面基板のエッジに、合計厚さ140 µmの両面テープ2片を配置してデバイスを組み立てます。

4 µLの脱イオン水をリザーバーの1つにピペットで注入し、パターンのない酸化インジウムスズ（ITO）スライドのテフロンコート面を下にしてデバイスの上に配置して密閉します。トッププレートに接地コネクタを取り付けます。LabVIEWで作成した初期化プログラムを実行してフィードバック制御をキャリブレーションすれば、デバイスは実験に使用可能な状態になります。

本プロトコルでは、デジタルマイクロフルイディクスの設計と使用法を実証するため、タンパク質サンプルとしてウシ血清アルブミン（BSA）を使用します。BSAは、100 mM Tris-HCl (pH 7.8) に 0.08% (w/v) のonic F1 27 を加えたワーキングバッファー（WB）で希釈します。各サンプルおよび試薬溶液を 1 mL ずつ調製し、それを注入するリザーバーを明記しておきます。

試薬の調製後、デバイスからトッププレートを取り外し、指定されたリザーバーに溶液を4 µLずつピペットで分注します。リザーバーへの充填後、トッププレートをデバイスに元に戻します。自作のLabVIEWプログラムを使用して、以下の手順を実行してください。

コンピューターインターフェースを使用して、リザーバーから約600 nanoliterの液滴を分注し、電極アレイ上で液滴を操作できることを念頭に置いてください。まず、R1からタンパク質を含む試料の液滴を、R2から沈殿剤の液滴をそれぞれ分注します。2つの液滴を融合させ、タンパク質が表面に沈殿するように、混合液滴を5分間インキュベートします。

上清を沈殿したタンパク質から遠ざけるように操作し、廃液リザーバーへ移動させます。次に、沈殿したタンパク質を洗浄するため、R fourから洗浄バッファーを3滴分 dispense し、沈殿したタンパク質の上を通過させて廃液リザーバーへと流します。沈殿物を乾燥させた後、R fiveから再溶解バッファーを1滴、タンパク質の上に dispense します。

沈殿物が溶解するまで、バッファーを20分間インキュベートします。次に、R6から還元剤を1滴分分注し、サンプル滴と混合させます。結合した滴を6つの電極上で円状に動作させ、混合してください。

液滴を室温で1時間インキュベートします。R7からアルキル化剤の液滴を分注し、サンプル液滴と合流させて混合します。その後、遮光した状態で室温で15分間インキュベートします。

最後に、R8からトリプシンを1滴分分注し、サンプル液滴と合流させて混合します。ホットプレート上のペトリ皿内で、37°Cで3時間インキュベートします。反応を終了させるため、トッププレートを取り除き、ピペッティングにより消化反応を停止させます。

2.5%トリクロロ酢酸水溶液を0.6 mL、反応液ドロップレットに滴下します。クエンチされた反応生成物を、ボトムプレートからサンプルドロップレットを直接サイフォンで吸い上げることで精製します。C 18 ZipTipを製造元の指示に従って使用し、必要に応じてサンプルを希釈し、質量分析によって評価することで、本システムを用いたサンプル中のタンパク質の同定が可能です。

続いて質量分析を行い、1×10⁻³未満の確率スコア（99.9%の信頼区間に相当）および30%以上のシーケンスカバレッジでタンパク質を同定しました。したがって、DMFは自動化されたプロテオミクス試料処理において非常に有用な手法です。本日は、タンパク質の抽出および処理を自動的に行うためにデジタルマイクロフルイディクスをどのように活用するかについて説明しました。この手法は、タンパク質の単離および同定における試料の損失や汚染に対する潜在的な解決策となります。

将来的には、この方法をイムノアッセイや細胞ベースのアッセイを含む、他の生物学的応用に適用したいと考えています。この種の実験を行う際に最も重要なことは、楽しむことを忘れないことです。以上となります。

ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りしております。