マイクロ流体プラットフォームを使用した高スループットのタンパク質発現ジェネレータ

本手順の全体的な目的は、精製ステップを必要としないモジュール式タンパク質アレイを作成し、あらゆるタンパク質ライブラリとの互換性を持たせることです。これは、まずアセンブリPCRを通じて合成遺伝子を生成し、次にそれらの合成遺伝子をエポキシスライド上にアレイ化することで達成されます。

マイクロ流体デバイスを作製するには、シリコン制御およびフローモールドを用いてPDMSを使用します。次に、マイクロ流体デバイスをスポットDNAアレイに合わせて整列させます。最後に、ウサギ網状赤血球ライゼートをマイクロ流体デバイス内に流し、タンパク質を発現させます。

最終的に、蛍光抗体標識により数千種類のタンパク質の発現を示す結果を得ることができます。マイクロ流体ベースの技術を、タンパク質マイクロアレイなどの既存の手法と比較した場合、いくつかの利点があります。DNAをマイクロアレイ化し、その後、デバイス上で細胞を用いてタンパク質を合成します。

したがって、タンパク質の精製は不要であり、タンパク質が乾燥することもありません。これにより、実験を通して新鮮な状態が維持されます。また、マイクロ流体技術によってより高い感度が得られます。マイクロ流体デバイスを作製するには、エラストマーの剥離を促進するため、シリコン製のコントロールモールドおよびフローモールドをクロロトリメチルシラン蒸気に10分間さらしてください。

ベーキング工程の後、シリコンベースのエラストマーと硬化剤を、コントロールモールド用には5:1、フローモールド用には20:1の2種類の異なる比率で混合して準備します。5:1に調製したPDMSをコントロール層の上に注ぎます。コントロール層を脱気し、80 °Cで30分間ベーキングします。

次に、20:1で混合したPDMSをフロー層にスピンコートし、2,600 RPMで60秒間回転させた後、80 °Cで30分間加熱します。SU-8パターンを剥がさないように注意しながら、コントロール層を型からゆっくりと分離させます。その後、メスを用いてデバイスの周囲を切り出し、顕微鏡下で鈍針を用いてコントロールチャネルへアクセスするための穴を開けます。

左上角から順に、フロー層とコントロール層を手動で位置合わせし、コントロール層のボタンバルブを反応チャンバーの中央に配置します。次に、1行目を合わせ、コントロール層を1行ずつ慎重に離していきます。すべてのボタンバルブが反応チャンバーの中央にあり、アドレスバルブおよび入力バルブがフローチャネルの正しい位置で交差していることを確認してください。

すべての行が揃うまで、局所的にこのプロセスを繰り返します。完全に揃ったら、側面と角から慎重に持ち上げ、PDMSの張りを解消します。その後、デバイスを80 °Cで2時間加熱してください。

周囲を切り、2層構造のデバイスをフローモールドのパンチ穴から剥がしてフローチャネルにアクセスし、デバイス用のDNA構築物を生成します。T7プロモーター、リボソーム結合部位、両端に異なるエピトープタグを持つオープンリーディングフレーム、およびT7ターミネーターで構成される合成遺伝子を生成するためにPCRを行います。合成遺伝子をアレイ用に準備するため、ポリエチレングリコールとD-トリオース二水和物の混合液を作成します。384ウェルプレートの各ウェルに、1反応あたり2 µLずつ分注します。

ウェルプレート。合成遺伝子を384ウェルプレートに分注します。その後、蒸留水を加え、最終容量を20 µLにします。

次に、マイクロアレイスポットを用いて、エポキシコーティングされたガラス基板上に一連の合成遺伝子を配置します。実体顕微鏡下で、DNAスポットがDNAチャンバーの中央に位置するように、マイクロ流体デバイスを遺伝子アレイに合わせて手動で調整します。その後、残りの行を直線状に整えます。

デバイス全体を微調整してPDMSへのストレスを軽減し、マイクロアレイへの良好な接着性を確保して仕上げます。局所的に持ち上げてください。最後に、ホットプレートを用いて80 °Cで一晩インキュベートし、デバイスをガラススライドに接合します。

このセクションでは、可視化のために食用色素を使用しています。コントロール層のバルブは、LabVIEWを使用してコンピュータから駆動されます。LabVIEWスクリプトは、電子制御ボックスを介して一連のソレノイドマイクロバルブを制御します。

ソレノイドバルブマニホールドを圧縮空気に接続し、デバイス上のコントロールバルブへの空気の流れと圧力を制御します。内径0.02 inchesの柔軟なプラスチックチューブとステンレスピンを使用して、デバイスをソレノイドバルブマニホールドに接続します。チューブに二回蒸留水を満たし、コントロール層のアクセスホールにピンを挿入します。

各チューブが対応するコントロールチャネルに接続されていることを確認してください。コントロールチャネルを活性化させるには、LabVIEWアプリケーションを起動し、空気圧を5 PSIに設定します。次に、LabVIEWスクリプトからバルブを操作して空気圧を印加します。これにより、水がPDMSコントロールチャネル内に押し込まれ、不良デバイスのコントロールチャネル間における潜在的なクロストークを確認することができます。

まず、サンドイッチバルブとアドレスバルブを満たします。その後、コントロールチャネルとバルブがすべて水で満たされたら、バルブをプライミングして、その下の流路を遮断します。まず空気圧を15 PSIまで上げ、次に個々のソレノイドバルブに接続されたオン・オフスイッチのセットを用いて、LabVIEWプログラムを通じて行います。

すべてのスイッチボタンをオンにしてすべてのバルブを動作させ、バルブがすべて開いていることを確認します。チューブをフロー入力端子の1つに接続し、4〜5 PSIでデバイスに空気を流します。これにより、ガラススライドに張り付いたバルブを剥がすことができます。

これによりデバイスのプライミングが完了し、可視化の準備が整いました。本セクションでは、試薬を可視化するために黄色食紅を使用しており、無色溶液は、表面へのタンパク質アレイの自己組織化を促進し、マイクロ流体デバイス内での非特異的吸着を防止するヒッピース（hippies）を表しています。表面を化学的に修飾するには、まず、必要な溶液が入った新しいチューブをデバイスのフローチャネルのいずれかに接続します。次に、チューブの反対側を手動マニホールドに接続し、空気圧フローを開きます。

新しいチューブに 40 µL のビオチン化 BSA を分注し、その約半分をデバイス内に 20 分間流します。各ステップの間は、50 mM HEPES を使用して未反応の基質を洗浄してください。次に、25 µL のストレプトアビジンを 20 分間流します。

ビオチン化BSAで洗浄した後、表面を活性化させるため、ボタン周囲をHB-PBSで5分間洗浄します。次にボタンバルブを閉じ、残りのビオチン化BSAを流し、再びHB-PBSで5分間洗浄します。最後に、ボタンの下にアンチHisタグアレイを作成するため、ボタンバルブを開放し、30 µLのPenta-his-biotinを20分間流して、デバイス上にタンパク質アレイを形成します。ネックバルブを開き、ウサギ網状赤血球を流します。

転写・翻訳共役反応溶液をデバイス経由でDNAチャンバーに迅速に導入します。次に、サンドイッチバルブを閉じて各遺伝子を周囲の環境から分離し、デバイスをホットプレート上で30 °Cで2.5時間インキュベートします。その後、C mix SI 3抗体を用いてタンパク質の末端を標識します。

最後に、532 nanometerのレーザーと575 nanometerの蛍光フィルターを備えたマイクロアレイスキャナーを使用して、タンパク質レベルを測定します。この図は、タンパク質アレイにおけるタンパク質発現レベルの変動を示しています。

通常、遺伝子ライブラリの20%は検出可能なレベルまで発現しません。バックグラウンドレベルは、DNAをスポットしていないチャンバーを用いて決定しました。したがって、対応するタンパク質チャンバーからの信号は、ノイズまたは標識抗体の非特異的吸着によるものです。

適切に実施すれば、デバイスの検証に4時間、チップの実験に5時間かかります。