電位感受性色素を用いてモルモット腸ネットワークにおける電気活動の光学的記録

このビデオでは、電位感受性色素D-4-ANEPPDHQを用いた、電気刺激による腸管神経系標本の解剖およびその後のイメージングについて説明します。安楽死させたモルモットから腸の一節を採取し、光学的な記録を行うために、まず粘膜下層を、最終的に筋層間神経叢を露出させる解剖を行います。高解像度の初期画像を撮影した後、D-4-ANEPPDHQで染色し、固定した組織に電極を配置します。

電気活動を示す光学的な変化を高速度カメラで記録します。高速度撮影中に、電気刺激を印加します。その後、高解像度画像を高速度カメラのピクセルマップに重ね合わせ、neuro plexを用いて解析します。

こんにちは。私はブライアン・サルツバーグです。ペンシルベニア大学神経科学科の細胞光学研究室（Laboratory of Cellular Optics）、通称locoのディレクターを務めています。私はアナリア・オビデです。私も細胞光学研究室のメンバーです。

本日は、電位感受性色素を用いて、無傷の哺乳類ニューロンネットワークから電気活動を記録する手順をご紹介します。この手法を用いて、腸管神経系（「第二の脳」または「腸の脳」とも呼ばれます）を構成する2つのネットワーク内およびネットワーク間のニューロン接続性を研究します。それでは始めましょう。

イソフルランによる吸入麻酔を施し、断頭させた150～200 g（または2～3週齢）のハートリーギニアピグの小腸を摘出し、粘膜下層および腸管神経叢の調製を開始します。次に、温めて酸素飽和させたM199 DM溶液で管腔内を洗浄し、腸内容物を除去します。極性を保持するように注意しながら、8～10 cmの長さで腸管分節を切断します。

それを、室温のM1 99 DMを入れたsardコーティング済みの10 centimeterガラスシャーレに移します。シャーレを暗視野照明を備えた解剖顕微鏡に設置します。次に、はさみを用いて腸間膜縁を切開し、昆虫ピンを使用して腸管セグメントの粘膜側を上にして固定します。

ピン留め後に組織が長方形になり、粘膜下神経叢の列が規則的に整列するように、均一な張力を維持することが極めて重要です。先端が直線のデュモント精密ピンセットをほぼ水平に保持します。腸管セグメントの一端にある神経叢を掴み、組織の長軸方向に沿って牽引して粘膜を剥離します。粘膜のリボン状の組織を分離し続け、粘膜下神経節と粘膜下血管を含む粘膜下層を露出させます。

次に、非常に精密な鋏を用いて、環状筋線維の走行に合わせて粘膜下層を切開します。続いて、環状筋を押し下げながら、精密ピンセットで粘膜下層を非常に慎重に持ち上げます。鋏を層間に挿入し、縦方向に沿って切開します。

剥離が進むにつれて、粘膜下層を準備試料の残りの部分から切り離します。次に、最初の切開部位から1.5〜3 cm離れた位置で、輪状筋線維の走行に沿って2回目の切開を行い、粘膜下層試料の最終的なサイズを決定します。得られた粘膜下層セグメントの厚さは30〜50 µmであり、薄い膜のような外観を呈します。これを新鮮なM1 99 DMを含む別のSylgardディッシュに移し、緊張をかけないように慎重にピンで固定します。

その後、ディッシュを室温の酸素供給チャンバーに入れ、後で使用できるようにします。この時点で、元の腸管セグメントから粘膜および粘膜下層が除去され、輪状筋が露出しているはずです。このセグメントを用いて、筋層間神経叢を露出させるための筋層間神経叢標本を作成します。

ストレートチップの微細ピンセットを用いて、標本の両側から繊維束を引き剥がし、輪状筋層を可能な限り除去します。露出した筋腸管神経叢は、縦走筋層およびその下の内環状筋（CI）から分離することはできません。筋腸管神経叢の標本を、酸素供給されたM1 99 Mを含む新しいサルガードコートディッシュに移します。次に、生存筋を含むサンプルを軽くピンで固定します。光学実験の数分前に、標本をnefe 2 µMを含むM1 99 DMが満たされた、より小さい新しいサルガードコートディッシュに移して筋収縮を防止し、周囲に非常に細いピンを複数配置して慎重にしっかりと固定します。

張力が均等に分散され、組織がシルガード製の底面に完全に平らに密着していることを確認します。これで、組織標本の生理学実験に向けた準備が完了しました。ガラスバイアルを用いて、2 µM nifedipineを含むM1 99 M溶液にDAI 4-ANEPP-HQを5〜50 µg/mLの濃度で溶解させた定常溶液を調製し、アルミホイルで遮光します。

ストックソリューション由来のエタノール濃度が、ニフェジピンを含むM1 99 DM溶液に対して0.5%未満になるようにし、標本を覆っていた溶液を調製済みの染色液に置き換えます。組織を完全に覆うのに十分な量のラダーを用いて、室温で10〜30分間インキュベートします。インキュベーション後、チャンバーの内容物をすべて入れ替えることで、酸素飽和M1 99 M plus NEFEを用いて標本を洗浄します。

電気刺激を与えた標本における神経活動の光学的な記録は、イメージスプリッターを備えた正立エピ蛍光顕微鏡、低解像度精密高速カメラ、高解像度白黒カメラ、コンピュータ制御の刺激発生装置、およびマイクロマニピュレーターで構成されるシステムを用いて行われます。装置全体はアクティブ防振テーブル上に設置され、空気伝播振動を最小限に抑えるために、厚手の遮音カーテンとマイラー製のルーフで囲われています。2台のカメラからの画像取得は、neuro plexとGlobal Lab image two、またはその他の画像取得ソフトウェアを動作させる1台のコンピュータで実行可能ですが、本構成では、光学実験を開始するために、それぞれ別のカメラを制御する2台のコンピュータを使用しています。

染色済みのパンニング試料を入れたチャンバーを顕微鏡ステージに設置します。D four A および EPPD HQ は、脂質環境下でのみ蛍光を発する膜不透過性染料であるため、染色した腸管調製物中の健全なニューロンを 20x 以上の倍率で観察すると、空の風船のような外観を呈します。励起には HQ 5 35 50 フィルター、蛍光には HQ 5 72 LP フィルター、および 5 65 nanometer ダイクロイックミラーを使用します。

次に、マイクロマニピュレーターを用いて、組織の口側端にマルチバレル線形マトリックスアレイ電極を配置します。その際、電極が顕微鏡対物レンズに接触しないように注意してください。1 cmの範囲に10本のタングステン電極が配置された線形マトリックスアレイは、複数の独立した神経経路を刺激することができ、相互に接続された神経節回路の研究に適しています。ただし、代表的なデータについては、自作の2リード刺激電極を使用しました。

機能的な記録を行う前に、タッキーワックスを用いてチャンバーの反対端に接地電極を配置し、電気活動を記録する領域の高解像度白黒画像を取得して視覚化を容易にします。蛍光部分が暗く表示されるように、グレースケールを反転させても構いません。コンピュータ制御の刺激発生装置を用いて電流刺激を適用するには、まず適切な強度、持続時間、周波数、刺激回数、および光学データ取得開始からの遅延時間を設定して、装置をプログラミングします。

刺激が光学データ取得の範囲内で行われるように、刺激発生器をneuro plex制御デバイスとして設定します。次に、フレームレート、フレーム数、およびカメラゲインを指定して、neuro plex内で取得パラメータを設定します。活動電位を完全に定義するには、フレームレートを最低1 kHzに設定する必要があります。

D-four-AおよびE-P-P-G-H-Qは、脱分極に伴い蛍光が減少しており、その減少は電圧変化に線形に相関するため、Neuroplex内で光学信号の表示を反転させ、活動電位が上下逆さまに表示されないようにします。データ収集を開始してください。各機能的記録を行う前に、各視野の高解像度白黒画像を新たに取得することを忘れないでください。

データ取得が完了したら、NeuroPlexを使用してオフラインで結果を解析します。画面上の「page display」と呼ばれる領域に、80×80高速カメラでキャプチャされたプレパレーションの粗い画像が個別のフレームとして表示されます。ページモードを「absolute frame」に設定すると、NeuroPlexのディスプレイコマンドを用いて、2台目のカメラで取得した高解像度画像が粗い画像のピクセルマップ上に重ね合わせて表示されます。

これには、ページモードを「absolute trace」から「traces」に変更し、ディスプレイコマンド内から重ね合わせ画像を選択する必要があります。マウスを使用して、ページディスプレイに表示された画像から個々のピクセルまたはピクセルのグループを選択します。これらの関心領域（ROI）の出力がトレースディスプレイウィンドウ内にトレースとして表示され、それらのピクセルによって記録された光学的な変化の大きさが時間の関数として明らかになります。

高解像度画像のグレースケールを反転させることで、トレースモードのページ表示における視認性が向上します。また、スティミュレーターからのアナログ出力を表示することを強く推奨します。トレース表示ウィンドウに含めるアナログ出力チャンネルを選択してください。この出力は、実験中に適用された刺激の正確なタイミングを示します。

データをムービーとして閲覧するには、neuro plex内のムービーコマンドを使用して、蛍光強度の最大および最小の変化に合わせて調整された擬似カラースケールを用いて、データセット内の連続するフレームを表示します。DIA four A-N-E-P-P-D-H-Qで染色した筋層間神経叢標本の神経節を、高解像度カメラと60x対物レンズで撮影しました。データ収集の間、標本に40 Hzで5回のパルス列による刺激を与えました。

各パルスの振幅を15 milliamps、持続時間を0.5 millisecondsとして、4つの関心領域（ROI）を特定し、選択した領域で平均化した光学データを表示するためのトレースを作成しました。擬似カラーフレームシーケンスにおいて、神経活動を示す膜脱分極の最初の光学応答領域は、黄色から赤色として現れます。これらのデータは、刺激によって誘発された活動が各神経節の離散的な領域で発生しており、その大部分が通過軸索によるものであることを示しています。ROI 2、3、および4は、ROI 1からさまざまな距離にある個々のニューロンを特定しています。

図2は、情報の伝播経路を10倍の倍率で示したものです。矢印は、特定された筋層間神経節を活性化させる刺激の進行方向を示しています。ここでは、電圧感受性色素を用いて電気活動を記録するための光学系の構成要素と、この技術を腸管神経系に適用することで、顕微鏡下で無傷の哺乳類ネットワーク内およびネットワーク間の機能的コネクティビティを研究できる可能性について説明しました。光学記録技術を使用する際は、細部への細心の注意が極めて重要です。

光学的なノイズ、機械的なノイズ、および電気的なノイズの発生源を慎重に制御し、プレパレーションの状態を細心の注意を払って維持する必要があります。したがって、光学記録を成功させるには、本プロトコルの個々のすべてのステップを習熟することが不可欠です。以上となります。

ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りいたします。