マイクロ流体フローセルを使用して流れの下で血小板粘着と凝集

BioFluxシステムは、制御されたせん断流下で生細胞アッセイを実行するための自動装置およびマイクロ流体デバイスです。本システムはウェルプレートマイクロ流体技術を用いており、ミクロンスケールのフローセルデバイスをSBS規格のウェルプレートに統合しています。BioFlexを使用することで、少量の血液量でハイスループットな血小板粘着および凝集研究を行うことが可能です。

蛍光染料で標識した全血をウェルに添加し、チャネル内に流します。制御されたせん断流の下で高解像度顕微鏡データを取得し、薬剤化合物やその他の変動パラメータが存在する場合における血小板の接着および凝集を定量化します。こんにちは、Flexion Biosciences社のRDラボのマイク・シュワルツです。

本日は、血小板粘着アッセイにおけるマイクロ流体フローセルの使用手順について解説します。当研究室では、このプロトコルをさまざまな血管生物学アッセイに活用しています。それでは、始めていきましょう。

フローセル実験を行う前に、BioFluxプレートのマイクロ流体チャネルを目的のタンパク質でコーティングして準備する必要があります。本実験ではcollagen oneを使用します。BioFluxプレートの24本の実験チャネルは、それぞれプレートの入口ウェルと出口ウェルに接続されています。入口ウェルはチャネルに液を供給する左側のウェルであり、出口ウェルは右側にあります。collagen oneストック溶液を200 µg/mLの濃度に希釈してください。

0.02 M 酢酸において、使用するチャンネルごとに 20 µL が必要になります。本実験では 11 チャンネルを必要とするため、コラーゲンコーティング液を 200 µL 調製します。1 つのチャンネルはコーティングせず、マイクロピペットチップを用いて穏やかに反復混合します。

マイクロピペットを用いて、各チャネルのウェル内側のパンチ部分にコーティング液を20 µLずつ分注します。黄色い染料で示すように、目的のマイクロ流体チャネルに液を供給します。この際、血小板の接着および凝集の陰性対照として、コラーゲンを含まないチャネルを1つ設けてください。すべての該当チャネルにコラーゲンコーティングを完了させた後、インターフェースをプレートに取り付けます。

bio flux 1000インターフェースを使用している場合は、両方のラッチをステージにしっかりと固定してください。Bio flux 200インターフェースを使用している場合は、まず4本のネジを締めます。その後、すべてが配置されたことを確認し、トルクドライバーを使用して完全に締め付けてください。

トルクドライバーは最大値に達するとクリック音が鳴ります。BioFluxソフトウェアのマニュアルモードを使用して、目的のチャネルに出口から2D per centimeter squaredの灌流を行います。顕微鏡の低倍率対物レンズを用いてインレットウェルを確認し、反対側のインナーパンチに液体が満たされるのを観察します。

まず、数分後から少量の液体が内部パンチにゆっくりと満たされるのが確認できます。入口の内部パンチが満たされたら、ソフトウェアのストップボタンを押し、すべてのチャネルの注入を停止してください。プレートを室温で1時間インキュベートします。このインキュベーション期間中に、全血の調製を開始し、1時間のインキュベーション終了までに準備を完了させてください。

血液の準備が完了したら、インターフェースを取り外し、カルシウムおよびマグネシウムイオンを含むPBS 1 mLを流出孔（アウトレット）に加えます。流出孔ウェルから2 dyn/cm²で灌流を開始し、10分間継続します。10分後、灌流を停止します。インターフェースを取り除いた後、流入孔（インレット）と流出孔ウェルの両方から余分なPBSを除去します。

インナーパンチを満たしている液体は決して除去しないでください。チャネルをブロックするには、各アウトレットウェルに1 mLのブロッキング溶液を加えます。使用するウェルを、2 µL/cm²の速度でアウトレットウェルから灌流させ、灌流を10分間継続します。

10分後に灌流を停止し、インターフェースを取り除きます。これでチャネルの準備が完了し、プレートにコラーゲンをコーティングしている間、一日を通して使用することが可能です。1時間のインキュベーションの間に、空腹状態の被験者から採取した新鮮なヒト血を、イメージングおよびプレートへの注入用に準備します。

血液はクエン酸ナトリウム抗凝固剤を用いて採取し、採取後3時間以内に使用してください。まず、DMSOに溶解した4 mMのカルシウムMストック溶液を、容量比1:1000の希釈率で血液に添加します。4 µMのカルシウム濃度とするため、緩やかに転倒混和して混ぜ合わせます。

次に、カルシウムラベルした血液1 mLを1.5 mLマイクロチューブ10本に分注します。各チューブに、目的の希釈率でGP2B3阻害抗体を添加します。抗体なしの陰性対照と、無関係な抗体を用いた陽性対照を必ず含め、緩やかな転倒混和によって混合してください。

フローセル実験を行う前に、チューブを室温で1時間インキュベートし、10分ごとに緩やかに転倒混和します。BioFluxコントロールモジュールで、コラーゲン用の自動プロトコルを設定する必要があります。1. 流出口から10分間、10 $\text{cm}^2$で血液を流すプロトコルを設定します。

BioFlex 1000ワークステーションを使用して、目的のステージ位置、取得する波長、およびタイムラプス設定を含むデータ取得パラメータを設定します。本プロトコルの典型的な画像取得プランでは、10倍対物レンズを用い、チャンネルあたり1つの視野を30秒間隔で合計10分間にわたって撮影します。また、視野を追加したり、別のタイムラプス設定を適用したりすることも可能です。

自動プロトコルとデータ取得パラメータの設定が完了したら、BioFlexプレートに戻り、内側のパンチ以外のチャネル両側の液体を除去します。迅速に作業し、各条件の血液500 µLを各チャネルの出力ウェルに入れます。血液をビューイングゾーンへ届ける最短経路であり、コラーゲンコーティングに対する血液のより即時的な反応を得られるため、出力ウェルを使用して血液を注入することに注意してください。

さらに、抗体を含まないコントロール血液を、コラーゲンでコーティングしたチャネルと、ブロッキングのみを行ったチャネルにそれぞれ注入します。プレートをBioFlex 1000ワークステーション顕微鏡に設置し、インターフェースに固定します。原点として定義される最初のキャリブレーションポイントを特定し、ステージリストのキャリブレーションを行います。

次に、2番目のキャリブレーションポイントを特定してマークします。このキャリブレーションを適切なステージリストに適用してください。これにより、プレート上のすべての観察位置を自動的に検出できるようになります。

ステージを血液を含むチャネルのひとつに移動させ、BioFlex montageソフトウェアで露光時間やゲインなどの画像キャプチャパラメータを設定します。目的のボタンをクリックして、適切なワークフローを開始します。これにより、フロープロトコルと画像取得が同時に開始されます。

実験の終了後、プレートをBIOFLU 1000ワークステーションから取り出し、施設のガイドラインに従って廃棄してください。BioFluxシステムのコラーゲンコーティングされたマイクロ流体チャネルを使用します。未処理の対照血液サンプルでは、時間の経過とともに激しい血栓形成が観察されます。

対照的に、コーティングされていないチャネルでは血栓形成は観察されません。最近行われたある実験では、コントロール条件下での凝集体の平均サイズは2000 µm²でした。GP IIb3aは、コラーゲンへの接着によって活性化されると、血小板間の相互作用と凝集の安定化を強力に媒介します。ここに示すように、せん断曝露の1時間前に抗GP IIb3a抗体でインキュベートした後では、血栓サイズの減少および血栓形成頻度の減少が観察されます。

通常、10 dyne cm⁻²において用量依存的な反応が観察され、この特定の阻害剤のIC₅₀値は17 nanomolarでした。抗体なしコントロールと比較したこのドナーの最大抑制率は、10 dyne cm⁻²で11%でした。また、最大200 dyne cm⁻²または5,000 s⁻¹までの全血実験に使用可能な48ウェル高せん断プレートも利用可能です。

以上で、生理学的に妥当な血管生物学実験を行うためのマイクロ流体フローチャネルの使用方法について説明しました。このプロトコルを実施する際は、適切なバッファーでコラーゲンを希釈することを忘れないでください。気泡の混入を防ぐため、常に正しいピペッティング技術を用い、常に研究室のバイオセーフティ規定に従ってください。

以上です。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りいたします。