シンプルで堅牢、かつ高スループットの単一分子 DNA 分子の輸送を研究するためのストレッチ法の実装を流れ

この手順の全体的な目標は、DNAに沿った分子の輸送を研究するための、シンプルで堅牢、かつ高スループットの単一分子フローストレッチアッセイを構築することです。これは、まずビオチン標識オリゴをラムダDNAにライゲーションすることにより、ビオチン標識ラムダDNAを調製することによって達成されます。第2ステップは、ポリエチレングリコールまたはPEG官能化カバースリップをワンステップ反応プロトコルに従って調製することです。

次に、PEG官能化カバースリップと、入口と出口の穴を含むポリジメチルシロキサンまたはPDMSスラブとの間に、事前にカットされたチャネルを備えた両面テープを挟むことにより、ハイスループットフローセルを構築します。最後のステップは、タイムラプス全反射蛍光またはTIRFイメージングを使用して、流路内の単一蛍光分子の軌跡を追跡することです。フローストレッチラムダDNAに沿って拡散する単一分子の軌跡を特定するために、信頼性が高く効率的なカスタム単一粒子追跡ソフトウェアを使用して、生の蛍光画像を分析します。

このアッセイ構成が他のアッセイと比較した場合の主な利点は、カバースリップ調製の信頼性、スループット容量の向上、サンプル調製のハンズオン時間の短縮、教師なしデータ解析の効率化です。その手順を実演するのは、私の研究室のポスドク、Kan Xiong博士です。このアッセイを開始する前に、プロトコルテキストに記載されているように、必要なすべての試薬を調製してください。

ミリグラム/ミリグラム/ミリグラムのラムダDNAストックを65°Cに60秒間加熱し、すぐに濡れた氷に飛び込みます。100マイクロリットルのラムダDNA溶液と2マイクロリットルの10マイクロモルビオチン標識オリゴを微量遠心チューブ内で混合します。混合物を摂氏65度で60秒間加熱し、その後ゆっくりと室温まで冷却します。

混合物を氷の上に置きます。11マイクロリットルのT4 DNAリガーゼ反応バッファーを加え、穏やかに混合します。次に、800ユニットのT4 DNAリガーゼに相当する2マイクロリットルを穏やかに混合します。

混合物を摂氏16度で2時間、または摂氏4度で一晩インキュベートします。公称分子量制限が100キロダルトンの遠心フィルターチューブを使用して製品を精製します。1番のカバーガラスを染色ジャー内で95%エタノールで10分間超音波処理し、次いで超純水で3回すすいでください。

染色ジャーに1モルの水酸化カリウムを入れ、再度10分間超音波処理した後、超純水で3回すすいでください。このサイクルを2回繰り返します。清潔で乾燥した窒素ガスの流れの下でカバースリップを乾かします。

さらに、900ミリトールの圧力で5分間エアプラズマ処理を行うことにより、カバーガラスを洗浄し、乾燥させます。カバースリップを50マイクロリットルの25ミリグラム/ミリリットルのシラン-ポリエチレングリコール-ビオチンを95%エタノールに溶解し、室温で2時間インキュベートします。余分なポリエチレングリコールを超純水で洗い流し、ポリエチレングリコールでコーティングされたカバースリップを清潔で乾燥した窒素ガスの流れで乾燥させます。

CADソフトウェアを使用してフローチャネルを設計し、テープカッターを使用して両面テープでチャネルをカットします。チャネル内の残留テープを削除します。PDMSスラブを作るには、ミキサーを使用して45グラムのPDMSと5グラムの架橋試薬を完全に混合します。

混合物を2つの100mmシャーレに注ぎ、すべての気泡がなくなるまで約30分間真空チャンバー内に置きます。PDMSが固まるまで、皿を摂氏80度のオーブンに約2時間放置します。あらかじめカットされたチャネルを備えた両面テープのサイズに一致するPDMSスラブを切り取ります。

両面テープから保護フィルムを1枚剥がし、PDMSスラブの平らな面に接着します。23ゲージの針を備えた生検ホールパンチャーを使用して、PDMSスラブに出口と入口の穴を開けます。両面テープからもう一方の保護フィルムをはがし、カバースリップの機能化された表面に接着します。

組み立てたフローセルを顕微鏡ステージインサートに固定します。脱気済みのすべての試薬を、ソレノイドバルブに接続されたTygonチューブと、試薬の逆流を防ぐPEEKチューブに接続された別のチューブがあるリザーバーにロードします。試薬の流れは、スクリプトプログラミングアプリケーションによって制御されるソレノイドバルブによって制御されます。

ブランクバッファに流れることにより、1つのフローチャネルをプライミングします。他の3つのPEEKチューブをインレットホールに挿入します。チャネル内に気泡が形成されないように注意してください。

タイゴンチューブを短いPEEKチューブで出口穴からサンプル廃棄物容器に接続します。0.2ミリグラム/ミリグラム/ミリリットルのストレプトアビジン溶液を流し、5分間インキュベートします。次に、ブランクバッファーに流して、結合していないストレプトアビジンを洗い流します。

1ミリグラムあたり1ミリグラムのウシ血清アルブミン溶液を流し、1分間インキュベートします。次に、ブランクバッファーに流して、未結合のウシ血清アルブミンを洗い流します。100ピコモルビオチン-ラムダ-DNA溶液に流し、10分間インキュベートします。

次に、ブランクバッファーに流し込み、未結合のラムダDNAを洗い流します。PEG官能基化カバースリップの品質を確認するため、SYTOX Orange色素などのDNA染色色素を流し込み、蛍光イメージングを開始します。カバーガラスの品質が良ければ、フローストレッチラムダDNAの密度は高くなります。

また、TIRF角度を調整して、ほぼ完全にフローストレッチされたラムダDNAの画像のS/N比を最高にします。単一分子の軌跡を追跡するには、新しいチャネル内でインキュベーションを開始し、シリンジポンプを使用してサブナノモル蛍光色素標識分子を十分な高流速で融合し、100ヘルツのフレームレートでタイムラプス蛍光画像を収集します。通常、10, 000フレームが1つの視野に収集され、複数の視野からのムービーが収集されます。

最後に、DNA染色色素を再度流し込み、DNAがフローストレッチできることを確認します。カスタムの単一粒子追跡ソフトウェアを使用して、DNAに沿って拡散する単一分子の軌跡を特定します。ソフトウェアは、最初に単一の粒子の重心位置を高精度で決定します。

カバースリップ表面に付着している粒子を取り除き、異なるフレーム内の粒子をリンクしてタイムラプス軌道を形成します。これらの軌跡から、1次元拡散定数が推定されます。データ分析を開始するには、スクリプトプログラミングアプリケーションを開き、単一粒子追跡ソフトウェアのディレクトリに移動します。

largedataprocess3.m という名前のスクリプトを開きます。定義すべき重要なパラメータの 1 つは、単一粒子検出のしきい値です。最適なしきい値を決定するには、determine_threshold_valueを実行します。

m スクリプトです。このスクリプトは、しきい値が単一パーティクルの検出にどのように影響するかを視覚化します。最適なしきい値を決定したら、largedataprocess3 を実行します。

m スクリプトです。単一粒子追跡解析の完了後、生の軌跡はtrajectory_filteringを実行してフィルタリングされます。m スクリプトです。

グラフィックユーザーインターフェースまたはGUIは、フィルタリングステップを視覚化するために構築されています。GUIパネルで、DNAに沿った最小変位MinXDispを2ピクセルに設定します。DNA の最大横方向の変位 MaxYDisp を 2 ピクセルに設定します。

フレームの最小数 minFrames を 10 に設定します。トリプレットの状態の最小数 minTriplets を 10 に設定します。DNAに沿った最小拡散定数をゼロに設定するD_par。

DNA 横方向の推定拡散定数 D_trans を 10 メガ塩基対/秒の 2 乗に設定します。最小統計量パラメーター Chi2 Stat をマイナス 5 に設定します。DNAを横切る方向に対するDNAに沿った変位の最小比MinX/Yを2に設定します。

これらのフィルタリングパラメータをパスするすべての未加工の軌跡は表1にリストされ、渡さない軌跡は表3にリストされます。表 1 の軌道番号をクリックします。軌道はグラフィック 1 と 2 で表示されます。

再生ボタンをクリックすると、生の蛍光画像が再生されます。この軌跡が単一分子のスライド軌跡である場合は、add to table2をクリックします。最終的に、table2 に追加されたすべての軌跡は、GUI を閉じるときに保存されます。

すべてのフィルタリングステップを通過した軌跡は、平均拡散定数が推定されるために一緒にプールされます。平均拡散定数を計算するには、スクリプトを calculate_mean_diffusion_constant.m だけ実行します。この手順は、in vitroで単一分子生物物理学を研究する多くの人々に利益をもたらします。