ロボット工学と植物組織における遺伝子発現の研究​​のための動的画像解析

この手順では、ロボティクスを用いて植物組織における遺伝子発現のダイナミクスを時系列でイメージングします。まず、リマ豆の種子を滅菌し、発芽させるために湿らせたペーパータオルを挟んだ組織培養容器に入れます。4日後、子葉を取り出し、GFPを融合させたプロモーターを含むDNA構築物をbombardment法で導入します。ペトリ皿に配置した子葉を、カスタム設計の2次元ロボティクス画像収集システムにセットします。ロボットは、各組織片の画像を100時間にわたり1時間ごとにキャプチャするようにプログラムされます。

画像に対して画像解析を行い、GFP発現強度の経時的な定量データを取得します。こんにちは、オハイオ州立大学園芸・作物科学科の植物形質転換研究室のディレクター、ジョン・ファイナーです。オハイオ州立大学の同研究室で博士課程に在籍しているカルロス・エルナンデス・ガルシアです。

本日、Carlosがグリーン蛍光タンパク質を用いて遺伝子発現と植物組織を解析するために私たちが開発したプロトコルをご紹介します。私たちは、OD活性の強度を測定するために、この研究室で開発した手順を用いています。この目的のために、レポーター遺伝子であるGFP遺伝子の上流にプロモーターをクローニングします。

ここでは、カスタム設計のロボット画像キャプチャシステムを用い、インゲンマメの茎にプロモーター制御を導入し、アプリケーションを送信する方法を説明します。最後に、画像解析のプロトコルについて詳しく解説します。それでは、手順を開始しましょう。まず、標準的な手順を用いてインゲンマメの種子を表面滅菌します。

滅菌した種子を湿らせたペーパータオルの層に挟んでマゼンタGA7コンテナに入れ、25 °Cで4日間インキュベートします。ここでは、プロモーターおよびプロモーターエレメントの解析に有用な高コピー数発現ベクターを使用します。このベクターにはGFP遺伝子が含まれており、パーティクルガン法による導入の約1〜2時間前に、形質転換組織におけるプロモーターまたはプロモーターエレメントの機能を可視化するために使用されます。

種皮からリマ豆のCU leadinを切り出します。パーティクル銃法に適したCU leadinは、切り出し直後に黄色から淡緑色で平坦であり、その後の画像解析を妨げるような損傷がないものである必要があります。12個のcu leadinを、MS塩、Bビタミン、3% sucrose、および0.2% gel rateを含み、pH 5.7に調整したOMS培地を入れたペトリ皿に配置します。次に、DNA構築物をM 10タングステン粒子に沈殿させます。まず、使用直前に粒子を滅菌水で再懸濁し、100 milligrams per milliliterの濃度にします。

次に、0.6 mLの遠心チューブに、25 µLの粒子、1 µg/µL濃度のDNA 5 µL、2.5 M塩化カルシウム 25 µL、および100 mMスペルミン 10 µLを加えます。このDNA調製液を氷上で5分間インキュベートし、その後、粒子の上の溶液50 µLを除去して捨てます。チューブの底に残ったDNAコート粒子を、ボルテックスミキサーで再懸濁させます。

ボルテックス直後に、2 µLのEloquaを分注します。このボルテックス工程を繰り返します。Eloquaを取り出すたびに、コーティング済み粒子は氷上に保持し、15分以内に使用してください。

DNAを粒子にコーティングしたので、2 µLの粒子をフィルタースクリーン中央にあるシリンジフィルターの上部から注入します。次に、シリンジフィルターを粒子流入ガン（PIG）チャンバー内のフィルター保持ユニットに設置します。ビーカーの底にスクリーンを融着させたバッフルの上に、リマ豆の種子を軸方向が上になるように配置します。

粒子銃チャンバー内で組織をbombardment（粒子照射）する際の支持台として使用するバッフルを設置します。組織に照射を行うには、まず真空へのバルブを開いてチャンバー内を排気します。真空度が760 millimeters of mercuryに達したら、ソレノイドを起動させてヘリウムを放出し、粒子を推進させます。

粒子を加速させるために使用するヘリウム圧力は 50 ～ 60 PSI です。粒子照射後、真空ラインバルブを閉じ、排気バルブを使用して真空を解除します。真空が解除されたら、チャンバーのドアを開けて照射済みの co leadin を取り出し、co leadin を a dal side に戻します。

定量および発現プロファイリングのため、OMS培地で培養します。各DNA構築物について、最低3つのコリードをbombardします。また、十分に研究された遺伝子発現プロファイルを示すポジティブコントロールも含めます。

共焦点リードはこれでイメージングの準備が整いました。水銀ランプを点灯し、30分間ウォームアップさせます。SPOT R-T-C-C-Dカメラおよび、8枚のプレートを保持するカスタム設計のロボティクスプラットフォームの駆動を制御するモーターコントローラーの電源を入れます。

MZ L3解剖顕微鏡で、励起波長480 nanometers、蛍光波長510 nanometersのGFP用フィルターセットを選択し、GFP検出用の設定を行います。次に、厚みのあるポリカーボネート製のペトリ皿蓋に70% ethanolをスプレーして滅菌します。ペトリ皿の底部を覆うために使用されるこの専用の蓋は、画像収集中の結露を防ぎます。

bombarded cuanを含むプレートをロボティクスプラットフォームに設置し、側面のセットスクリューを締めて固定します。次に、ロボティクスプラットフォームと画像取得の両方を制御するカスタムソフトウェアアプリケーションを開きます。また、ソフトウェアを使用してホワイトライトコントローラーのスイッチをオンにし、プラットフォームをホームポジションに合わせて調整します。

これはポジション設定の前に行います。モータータブにあるすべてのcoddle leadinに対して、最初のプレートを選択してください。プラットフォームがペトリ皿の中心を顕微鏡の対物レンズの下に配置します。

移動距離ボタンを使用して、画像収集のための最初のCU LEADINを正確に配置します。ライブモード機能を使用して、cuddle leadenを適切な観察領域に移動させます。最初のcuddle leadenについては、実体顕微鏡のマニュアルノブを使用して焦点を合わせ、倍率を1.6 xに設定してください。関心領域が設定されたら、「add this position」ボタンをクリックします。

ソフトウェアがこの領域の座標をポジションスケジュールファイルに追加し、プラットフォームはプレート上の残りのすべてのcoenについて、プレートの中心に設定された位置に戻ります。移動距離ボタンを使用して、ロボティクスプラットフォームの各プレート下にある3つの手動レベリングネジを回し、同じプレート上の残りのcoanのフォーカスを調整します。すべてのcoanの座標入力が完了した後、ポジションスケジュールの座標を保存してください。

付随する書面プロトコルに従い、光の種類（GFPの場合はブルー）や露光設定などの画像収集パラメータを入力し、画像の保存先を指定します。「capture time control」タブに移動し、画像取得の時間間隔と画像収集の総サイクル数を設定します。通常、画像は1時間ごとに100時間収集します。

明確に定義された遺伝子発現プロファイルを生成します。ポジションスケジュールタブを開き、[Run Schedule]ボタンをクリックして画像取得を開始します。100時間の画像収集終了後、画像収集システムを外光から遮断してください。

各5 MB程度の高解像度画像を用いて、画像解析を行います。Image Readyを使用し、各フォルダから100枚の連続画像を組み立てます。すべての連続画像をフレームとしてインポートし、画像処理を高速化させるため、サイズを800×600ピクセルに変更します。

次に、すべてのフレームで表示される新しく導入したレイヤーを使用し、画像リファレンス内の選択したGFPスポットにマークを付けます。各画像を個別に手動で位置合わせし、アライメントが完了したらリファレンスとして使用したレイヤーを削除し、ファイルを単一のPSDファイルとして保存します。また、すべてのフレームを最高解像度で単一のMOVファイルとして書き出します。

これでGFP定量を開始するためのファイルの準備が整いました。ImageJを使用してMOVファイルを開き、400×300ピクセルの領域をクロップします。次に、RGB分割ツールを用いて、連続画像を赤、青、緑のチャンネルに分離し、赤と緑のチャンネルを抽出します。

各スライス用にROI測定値を減算するプラグインツールを用いて、背景蛍光を差し引きます。しきい値レベルを調整し、ピクセルあたりの平均グレースケール値およびGFP発現ピクセルの総数を測定するように設計されたプラグインを使用して、GFP発現量を算出します。ImageJで出力値をコピーします。最後に、グリーンチャネルとレッドチャネルの出力値をMicrosoft Officeに貼り付けます。

画像アライメントの結果を把握するため、さらなるデータ操作にExcelを使用します。この最初のアニメーションは、100時間の実験中におけるロボティクスプラットフォームの再配置の不正確さを示しています。スポットの移動は、手動による画像アライメント後、ロボティクスプラットフォームが各タイムポイントで正確に同じ位置に戻れないことによって生じるアーティファクトです。GFP発現細胞を容易に観察することができ、このトラッキングシステムの独自の機能が容易に可視化されます。

このアニメーションが繰り返される際に、丸で囲まれたGFP発現細胞に注目してください。赤色の丸で囲まれた細胞では、粒子銃法による導入から18〜20時間後に発現が急速に低下しているのに対し、白色の丸で囲まれた細胞では、GFP発現の開始が遅れていることがわかります。アニメーション以外にも、この手法を用いることで、リマメカゴニの標的組織におけるGFP発現の経時的な迅速定量が可能となります。これらの代表的な結果は、CAMV 35 Sプロモーターと4種類の異なるダイズプロモーターを用いたプロモーター強度の比較定量を示しています。

以上で、発芽したカタリンにDNAを導入する方法について説明しました。リマ豆の種子をロボット上のカタリンに配置し、画像解析用の画像を収集し、それらの画像を解析します。当研究室では、クローン植物プロモーターの検証にこの手順を日常的に使用しています。

さまざまな植物プロモーターを導入することで、大量のデータを生成することが可能です。しかし、この手順は複雑であり、多くの段階で失敗が生じる可能性があります。この操作を行う際は、新鮮なライム・ビーン（line bean）の種子から開始するか、少なくとも適切に保存された高品質な種子を使用することが重要です。また、ボンバードカットした蓋を迅速に取得してロボットにセットすること、および結露の問題を最小限に抑えるために厚いペトリ皿の蓋を使用することが重要です。

最後に、私たちが使用しているGFPは、ハーバード大学のGen HIN LabによるSGFPと呼ばれる別のバージョンであることにご注意ください。このGFPはあまり安定していませんが、遺伝子発現の急速な変化を追跡するのに適しています。ご視聴ありがとうございました。

それでは、実験の成功を願っております。