速度論と構造機能解析のアフィニティ定量のための適切なタンパク質濃度の重要性

このビデオ記事の全体的な目的は、次の2つの問いに対する答えを提供することです。第一に、タンパク質サンプルのうち、実際に別のタンパク質に結合可能な画分を測定することで、タンパク質相互作用の研究の信頼性を高めることができるか。第二に、速度論的解析によって、構造と機能の関係についての理解をどのように深めることができるか、ということです。

これらの問いは、ラベルを使用せずにタンパク質間相互作用をリアルタイムで検出する装置であるCorp X 100を用いた実験で検討されます。この実験では、ウシ由来シスタチンBとシステインプロテアーゼであるパパインの相互作用を検証します。これら2つのタンパク質の複合体の結晶構造から、プロテアーゼへの結合に関与するいくつかの残基が特定されており、それぞれの相互作用残基がシスタチンBとパパインの相互作用にどのように影響するかを決定します。部位特異的変異導入により、いくつかのシスタチンB変異体が作製されます。

このような実験では、組換えタンパク質が正しく折りたたまれなかったり、凝集や劣化が起こったりして、不正確で再現性のない結果を招く可能性があります。VIACORE X 100は、CFCA（calibration free concentration analysis：校正不要濃度分析）と呼ばれる手法により、結合可能なタンパク質の画分を決定することが可能です。このアプローチにより、校正標準物質が入手できない場合であっても、結合活性を保持しているタンパク質の濃度を決定することができます。

ここでは、シスタチンB変異体の濃度を決定するためにCFCAを使用します。これらのデータは、BOR X 100を用いて評価される、シスタチンB変異体とPepinの結合キネティクスの決定における入力データとして使用されます。こんにちは、スウェーデンのGEヘルスケアのCLA gramです。

本日、同僚のEva Poolが、Biorigin X 100を用いた構造機能相関解析の方法について解説します。リコンビナントタンパク質は、時間の経過とともに不適切な折り畳みが生じたり、結合活性が低下したりすることがありますが、このような挙動は全濃度測定に依存する方法では検出できません。その結果、キャリブレーションフリー濃度分析による濃度測定後の速度論的データが不正確になる可能性があります。Biorigin X 100は、シスタチンB変異体とペプシンとの相互作用の速度論および親和性を解析するために使用されます。

これらのパラメータから、結合メカニズムに関する知見が得られます。まず、実験デザインについて簡単に説明しますので、それでは始めていきましょう。結晶構造により、システインプロテアーゼであるパパインと阻害剤であるシスタチンBの複合体における相互作用は、疎水性接触が支配的であることが明らかになっています。

阻害剤側では、接触領域はN末端およびC末端のN、ならびに2つのヘアピンループです。本研究では、シスタチンBの二量体化を防ぐために3つのシステイン変異を導入した4つの変異体を検討しました。結晶構造で明らかになったコンテキストに基づき、ロイシン73をグリシンに、ヒスチジン75をグリシンに、そしてチロシン97をアラニンに変異させました。2つのグリシン変異は、ペプシンへの結合におけるヒスチジン75およびロイシン73の側鎖の重要性を検討するために導入され、チロシン残基のアラニン変異は、シスタチンBのC末端とペプシンの間の相互作用を調査するために行われました。

3種類の二重変異体およびINE 3のシリアン単一変異体を用いて、触媒不活性型バリアントであるPapain Sメチルパパインとの相互作用を試験します。このプロテアーゼの触媒不活性型は、活性部位のCYS 25にメチル基が付加されています。簡略化のため、本プロトコルを通してこのバリアントをpropanと呼びます。

CFCAは、表面へのアナライト分子の拡散によって速度が制限される条件下での結合速度の測定に基づいています。これは、リガンドの高密度な固定化によって促進されます。固定化の手順を開始する前に、実験に使用するHEPs緩衝液を左側のトレイに配置し、両方のチューブを挿入してください。

また、右側のトレイに空の廃棄ボトルを配置します。次に、新しいセンサーGypsum 5を装置に挿入し、Core X 100ソフトウェアを介して初期化します。開始画面で「dock chip tool」項目をクリックし、ソフトウェア内の「start doc」をクリックします。

次に、固定化ウィザードを使用して、固定化の手順を設定します。スタート画面から「Amine Coupling to Sensor CM5」を目的として設定し、「Other Options」ボタンをクリックして「Wizards」を選択してください。これにより、利用可能なウィザードの一覧ウィンドウが表示されます。「Immobilization」を選択し、右下の「New」ボタンをクリックしてください。すると、固定化ウィザードの最初の画面が表示され、「Amine Coupling to Sensor CM5」がデフォルトで設定されます。

フローセル2に固定化するために、フローセル2の下にあるボックスにチェックを入れます。以下にある3つのオプションから、参照表面として使用するためにフローセル1は未修飾のままにします。右側の「specify contact time」ボックスにチェックを入れると、ターゲットレベルがコンタクトタイムに変更されるので、コンタクトタイムを900 secondsに指定します。

次に、「capturing molecule / ligand solution（捕捉分子/リガンド溶液）」に固定化パラメータを入力します。「papain」と入力し、「next」をクリックしてください。

次の画面にサンプルラックのレイアウトが表示されます。ポジション1には、リガンドであるpapainをチップ表面にカップリングさせた後に、残りの活性基を不活性化するためのエタノールアミンを配置します。ポジション1にエタノールアミン溶液を、ポジション2に挿入してください。

リガンドのパパインを準備します。パパインは過剰量の硫酸メチル中で保存されており、10 mM 酢酸ナトリウム緩衝液（pH 4.5）を用いて 50 µg/mL に希釈します。アミンカップリングキットに含まれる EDC および NHS カップリング試薬を二回蒸留水で再構成します。EDC 85 µL をバイアルにピペッティングし、キャップをして 3 番の位置に配置します。

4番目の位置にNHSを同量使用します。機器がこのファイル内でED、C、およびNHSを混合させるために、ファイル5はキャップが閉まっており、空である必要があることに注意してください。また、H2Oの位置にある洗浄ファイルに、新鮮な脱イオン水を満たすことも忘れないでください。

画面上のアウトラインに従ってラックに充填した後、「load samples」をクリックし、ラックを装置にロードします。ラックのロードが完了したら、「next」をクリックしてください。ランが開始される前に、チェックリストが表示されます。

すべての箇条書き項目が確実に満たされていることを確認してください。スタートボタンを押すとランが開始されます。ランは固定化の手順中に開始されます。

データはリアルタイムで収集されます。まず、カップリング剤を注入します。次に、ペプチドをチップ表面にカップリングさせ、最後に残りの活性エステルを不活性化して手順を終了します。

ラン終了後、ダイアログウィンドウに実行結果の要約が表示されます。このウィンドウで、固定化レベルを確認できます。カップリング手順全体で、約3000 RUのパパインが固定化されるはずです。

パパインをセンサーチップに固定した後、シスタチンB変異体サンプルの総濃度が約10 nanomolarになるように、少なくとも300 microlitersまで希釈してCFCA分析を開始します。この希釈倍率は、後のアッセイセットアップで使用するため記録しておきます。まず、前節で説明した通り、アッセイフォルダーの濃度セクションでウィザードダイアログを起動します。

「calibration free」を選択し、次に「new」を選択します。ウィザードの最初の画面に注入シーケンスが表示されます。ここではセンサーチップCM5と直接固定化アッセイ法を使用するため、設定は変更せずにそのままにしておきます。

次の画面で「next」をクリックします。「prime before run」と「run startup cycles」のチェックボックスにチェックが入ったままにします。また、デフォルトのスタートアップサイクル数（3回）は変更しないでください。

溶液名のフィールドにheaps bufferと入力します。次に「次へ」をクリックします。次の画面で、再生溶液の名前として20 millimolar 水酸化ナトリウムを入力します。

その他のパラメータは変更せずに、[次へ]をクリックしてサンプルテーブルを確認してください。サンプルテーブルに従ってサンプルを準備します。

サンプルテーブルの各行につき、2回のサイクルが実行されます。1回は10 µL/minの流速で、もう1回は100 µL/minの流速で実施します。まずブランクからランを開始してください。

次に、希釈倍率、20 °Cにおける拡散係数、および分子量を入力します。各変異体について、拡散係数は製品ウェブサイト上のウェブツールを使用して算出できます。このツールへのリンクは、ソフトウェアのサポートナビゲーターに提供されています。

各サンプルをデュプリケート（2回繰り返し）で測定することが推奨されるため、空白行から最後のサンプルまでの表全体をコピーし、表の下部に貼り付けます。[次へ]をクリックして進んでください。次の画面にサンプルラックが表示されます。

ソフトウェアで指定されたレイアウトに従って、サンプルと試薬をラックに配置します。[load samples]ボタンを押して、ラックを装置にロードします。次に、[next]をクリックします。

サンプルのロード後、チェックリスト付きのリマインダー画面が表示されます。すべてを確認し、スタートボタンを押してください。データはラン中にリアルタイムで収集されます。

ランが完了したら、収集データが表示されているウィンドウを閉じます。メインウィンドウに新しい結果項目が表示されたことを確認してください。データから濃度を算出するには、その新しい結果項目を選択し、ボタンをクリックします。

core X 100を用いて評価を行います。評価ソフトウェアを起動し、ツールバーから収集したすべてのデータを表示させ、メニューから「concentration analysis（濃度分析）」を選択し、次に「calibration free（キャリブレーションフリー）」を選択します。最初のウィンドウで、分析に含めるデータを選択してください。

リストをスクロールし、ビューリストを順に確認して、すべてのサンプルのデータを表示してください。データを除外したい場合は、リストのチェックマークを外します。「次へ」をクリックして計算を開始してください。

CFCA相互作用モデルは、フィッティング完了時に実験データに自動的に適合され、結果がサンプルごとに結果ウィンドウに表示されます。表の該当する行を選択して、各サンプルのフィッティング結果を順に確認してください。「measured concentration」という列には、分析したサンプル中の濃度が表示されます。

元のサンプルの濃度は、先ほど入力した希釈係数を用いて計算され、「calculated concentration」の列に表示されます。完了したら、「finish」をクリックして結果を保存してください。CFCA分析によってタンパク質の濃度が判明したため、その後の速度論的測定を行うための優れた基礎が得られました。ここからの速度論的分析により、結合メカニズムにおける主要なアミノ酸残基の重要性を理解することができます。

キネティック解析のセットアップを開始しましょう。まず、スタート画面で新しいセンサーチップCM5を装置にドッキングさせます。次に、キネティック親和性のためのアッセイワークフローを作成します。

左上にダイアログウィンドウが表示され、リガンドに関する情報を入力します。リガンド名ボックスにpapainと入力し、種（species）のタイプリストから別のタンパク質を選択します。次に、提示された2つのリガンド固定化法から「sensor chip CM5を用いてリガンドを共有結合で固定化する」を選択すると、ウィンドウの右側に推奨されるアッセイワークフローの概要が表示されます。

まず固定化ステップを行い、次にアッセイステップを行います。「continue」を押して進めてください。指示に従って名前を入力し、「save」を押してアッセイワークフローを保存してください。

ソフトウェアにアッセイのワークフローが表示され、各ステップに対応するボタンが配置されます。「センサー表面の調製」の最初のステップは「固定化pHの決定」です。このpHが既知である場合は、表示されるダイアログボックスで「既知の値を入力」を押してください。

バッファー名にacetate、pHに4.5と入力し、saveを選択します。アッセイワークフローが更新され、このステップが完了したことを示す緑色のチェックマークが表示されます。次に固定化を行うため、immobilizedステップのrunボタンを押してください。

これにより、プロパンおよびCFCA分析の固定化で使用したものと同じウィザードが表示されます。速度論的解析のためのパパインの固定化も、ここでは同様に設定しますが、より希釈した溶液をより短い時間注入します。これは、シスタチンB変異体の結合速度が拡散によって制限される状況を避け、速度論的データを独立して測定できるように、固定化するパパインの量を少なくするためです。リガンド名と固定化pHはアッセイワークフローの前段階で入力されているため、ここではどちらもプリセットされています。

唯一必要な変更点は、接触時間を50秒とすることです。その後は、以前に示した通りに固定化を行います。固定化後の期待される結合レベルは50 R ruです。

実行ボタンの横に緑色のチェックマークが表示されていれば、固定化が完了したことを示します。次に、ワークフローのステップで再生溶液を入力してください。表示されるダイアログボックスの「既知の値を入力（enter known values）」をクリックして、再生条件を確認してください。

再生溶液とコンタクト時間を入力し、「保存」をクリックします。リガンドの固定化および再生条件の入力が完了し、キネティクスデータの生成準備が整いました。「Run Kinetics（キネティクス実行）」アッセイボックスの「Run」ボタンを押し、キネティクス測定の最初のステップを開始してください。

Affinity wizardは、ここで使用されるシングルサイクルキネティクスにおける各サイクルの注入シーケンスの概要を示します。変更の必要はありません。「次へ」をクリックして進んでください。次のステップでは、ラン前にシステムのプライミングを行うデフォルト設定のままにしてください。

チップ表面を平衡化させるため、スタートアップサイクルを1回実行することを選択します。次に、サンプルの注入パラメータを設定します。再生溶液は先に指定されており、設定が事前定義されているため、画面上のパラメータを変更する必要はありません。

「次へ」をクリックします。最後に、サンプルを指定します。各変異体について、ブランクとサンプルとして2行入力してください。

最高濃度パラメーターをゼロに設定することで、ブランクサイクルが指定されます。1回のランにつき、2種類のCystatin B変異体を適合させることができます。各変異体について、分子量、最高濃度、および希釈係数を入力し、「Next」を押してください。

次の画面で、サンプルラックの配置が示されています。タンパク質サンプルの希釈系列を調製し、キャップ付きのバイアルをラックに配置してください。画面の指示通り、ポジション13にバッファーのバイアルを、ポジション14に再生溶液のバイアルを配置します。水を入れるポジションには、必ず新鮮な水を補充してください。

ラックを装置内にセットし、「load samples」ボタンを押してサンプルをロードしてから、「next」をクリックします。 l前と同様に、最終確認を行った後、「start」を押して実験を開始してください。インタラクションデータがリアルタイムで表示されます。ランが終了したら、直ちに先ほどの実演に従い、残りのcystatin B変異体のランに進んでください。

残りのcystatin B変異体を連続して走行させる場合は、ステップ内の該当するチェックボックスを外して、プライミングステップとスタートアップサイクルを省略してください。各ランが完了すると、リンクからデータにアクセスできます。アッセイワークフロー内のすべての結果を確認してください。

このワークフロー内で生成されたすべての結果を含むダイアログウィンドウが表示されます。速度論的速度定数を算出するには、評価する結果を選択して「evaluate」を押すと、Core X 100評価ソフトウェアが再度起動し、すべての収集データが表示されます。ツールバーメニューから「kinetics affinity」を選択してください。

最初の画面では、システイン3か所をセリンに置換した変異体が評価のために選択されます。この変異体のデータは、この変異体に対して行われたブランクランの結果とともに表示されます。「Next」をクリックして次へ進んでください。次の画面には、サンプルのランからブランクランを差し引いたデータが表示されます。

キネティクスボタンをクリックして、キネティクス評価を選択します。次に、データを1対1相互作用モデルにフィットさせるように選択します。[fit]ボタンをクリックすると、計算されるとともにフィット結果が画面に表示されます。

準備が整うと、品質管理（クオリティコントロール）が自動的に適用され、下部にハイライト表示されます。品質管理項目を確認し、センサーグラムのデータを見て、センサーグラムに十分な曲率があるかを確認してください。また、収集したデータとフィッティングモデルとの差を示す残差プロットも確認してください。

系統的かつ非ランダムな偏差に注意してください。このフィットは許容範囲内です。次に、レポートタブにあるキネティックデータを確認してください。

結合速度定数、解離速度定数、および平衡解離定数です。完了したら「finish」を押し、他のすべての変異体についても同様の手順を繰り返します。以下は、検討したさまざまなシスタチンB変異体のCFCA分析における代表的な結果です。

特異的結合濃度データは、10および100 µL/minの流速で得られたセンサーグラムから抽出します。2回の80測定によって決定された濃度をCFCAによる決定値と比較すると、leucine 73 glycine変異体では、ほとんどの場合にタンパク質が完全に活性を有している一方で、活性タンパク質の割合が非常に低いことが分かります。cystatin B変異体のpepinへの結合キネティクスは、シングルサイクルキネティクスを用いて決定します。

センサーグラムは、1対1結合モデルの速度論的解析結果（黒色で重ね書き）を含む、ブランクおよびリファレンス減算後のデータを示しています。CFCAによって測定されたleucine 73変異体の特異的結合濃度は、two 80測定で決定された全タンパク質濃度の約10%に過ぎません。速度論的パラメータの算出に正しい濃度を用いた場合、leucine 73の結合速度は他の変異体と同等であることが明確になります。

変異体の結合速度は野生型タンパク質と同等である一方、変異体の解離速度定数は最大で2桁近く高く、それに伴い平衡解離定数も増大します。親和性の低下は主に解離速度の増加に起因しており、これは第2結合ループとシスタチンBのC末端の両方が、複合体形成後に阻害剤を酵素に結合させたままにすることで結合親和性に寄与していることを示しています。変異体の一つに極めて低い結合活性が見られたため、この結論を導き出すにはキャリブレーションフリー濃度分析の利用が不可欠でした。同僚のPolが、構造・機能研究におけるbi core X 100の使用方法を説明しました。これらの実験を行う際は、濃度分析と速度論的分析の両方が同じ結合手順に基づいているものの、実験条件が大きく異なることを覚えておくことが重要です。