構造質量分析法によって大きなタンパク質複合体の分析

本実験の目的は、構造質量分析を用いて巨大なタンパク質複合体を特性評価することである。まず、ナノフロー電相反射イオン化用の金メッキキャピラリーを調製する。次に、試料の調製を行い、高質量測定に向けて質量分析計の校正を行う。

次に、気相中でタンパク質複合体をそのままの状態（intact）で維持するために、実験条件の最適化を行います。その後、MSおよびタンデムMSスペクトルを取得します。MSスペクトルでは、保存された複合体の質量に相当する電荷状態が示され、タンデムMS実験では、モノマーおよびストリップされた複合体の会合パターンが得られました。

こんにちは。Whiteman科学研究所のMiron研究室のNaam Kibaです。そして私はIsaac Kyです。私も同じくMiron研究室に所属しています。本日は、構造スペクトロメトリーを応用した巨大タンパク質複合体分析の基本手順をご紹介します。当研究室では、タンパク質複合体のストックの幾何学的構造、組成、および相互作用ネットワークを定義するためにこの手順を用いています。それでは、始めましょう。

非電流結合タンパク質複合体の解析は、AsMe PlusまたはA-Quaキャピラリーを用いたエアスプレイ免疫法によって行われます。このキャピラリーCは、直径約1 µmの微細な先端にまで延伸させることができ、その後、金などの導電性材料でコーティングされます。これらのキャピラリーは、こちらでご覧いただけるように市販されています。

しかしながら、こちらの方法の方がはるかに費用対効果が高くなります。ガラスキャピラリーは、冷却およびコーティングによって使用可能な状態に準備されます。冷却はこのニードルプーリングデバイスで、コーティングはこのコーティングデバイスで行います。この手順を開始するには、ペトリ皿の底に両面粘着パッドを2本のストリップ状に貼り付け、ストリップの間隔を2 cmに保ちます。

パッドの1つの中心にガラス棒を配置します。粘着パッドはキャピラリーを固定し、ガラス棒は準備したキャピラリーを支持して、その先端が折れるのを防ぎます。外径1 mm、内径0.78 mmのボロシリケートガラスキャピラリーを使用しました。

キャピラリー1本をニードルに挿入し、キャピラリーを軽く固定して、加熱フィラメントの中心に位置するように調整します。キャピラリーの両端がしっかりと固定されるまで、クランプを緩やかに締めます。ここに示されている定義済みのプログラムを使用して、キャピラリーを引き伸ばします。

ただし、プルヤーのプログラミングは試行錯誤のプロセスであることを覚えておいてください。許容できるチップ形状が得られるまで、キャピラリーを1回引くごとに、最終的な形状をした2本のキャピラリーが作成されます。器具から引いたキャピラリーを取り出してチップを検査し、変形または破損しているものは廃棄してください。

鈍端のポジショニングピンセットを使用して、キャピラリーをシャーレに配置します。キャピラリーの底部を粘着パッドに固定し、上部はガラス棒に寄りかからせて、先端が上を向くようにします。シャーレがいっぱいになるまで、キャピラリーを配置し続けます。

直径10センチメートルのディッシュに、約80本のキャピラリーが収まります。次に、キャピラリーを金でコーティングします。プレートを金スパッタコーターに挿入してください。

メーカーの指示に従ってガス供給を選択し、あらかじめ設定されたコーティングサイクルを開始させます。キャピラリーが均一に金色になるまで、コーティングを3回から6回繰り返します。キャピラリーの準備が完了したら、質量分析計のキャリブレーションに進みます。

MultiPro複合体を用いて行われる実験の大部分は、このようなエレクトロスプレー四極子飛行時間型質量分析計で実施されます。これは高質量分析用に модиified されたWaters社製の装置です。タンパク質試料をロードする前に、ヨウ化セシウムを用いて質量分析計の校正を行ってください。

まず、高質量校正に使用するセシウムの100 mg/mL溶液を精製水で調製します。1価の塩クラスターは、質量電荷比393から10,000を大幅に超える範囲まで広がるためです。丸い先端のピンセットを使用して、ペトリ皿からコーティングされたキャピラリーを取り出し、2 µLのセシウム溶液をキャピラリーに充填します。

einorゲル充填チップを使用します。手動またはスピンダウンアダプターを用いて、溶液をキャピラリーの先端方向へ移動させます。キャピラリーをキャピラリーホルダーに挿入し、先端がホルダーの端から約10 millimeters離れるように調整します。

キャピラリーを光学顕微鏡下に置き、鋭利なAA型ピンセットを使用して先端をトリミングします。流れを妨げる気泡がキャピラリー内にないこと、およびキャピラリーが詰まっていないことを確認することが重要です。さらに、キャピラリーから金コーティングが剥がれていないことを確認してください。

その場合は、キャピラリーを交換するか、チップをトリミングしてコーティングされていない部分を取り除いてください。次に、キャピラリーホルダーをナノフローESIインターフェースに接続します。キャピラリーの損傷を防ぐため、XYおよびZステージを後方に回転させ、ステージを活性化位置まで押し込みます。

キャピラリーをコーンオリフィスから1～10 mmの距離に配置します。スプレーが開始されるまで、キャピラリー電圧と低ナノフロー圧を印加します。その後、ナノフロー圧を最小限の値まで下げてください。

XYZステージの位置、キャピラリー電圧、ナノフロー圧力、および脱溶媒ガス流量を調整して、信号強度を最適化します。広範な質量範囲のシーズンピークシリーズを検出するためには、加速電圧を最適化する必要があります。ここで使用したパラメータは、キャピラリー電圧 1.3 to 1.7 kilovolts、サンプルコーン 80 to 150 volts、および高質量イオンの透過性を最適化するためのエクストラクションコーン 1 to 3 voltsであり、高質量イオンには緩やかな脱溶媒条件が必要です。

光源と分析器の間の初期真空段階において、バッキング圧を5～6 millibarまで上げます。バッキング圧を上げるには、信号強度への影響をモニタリングしながら、アイソレーションバルブを部分的に閉じて、光源真空ラインからスクロールポンプへのコンダクタンスを慎重に低下させます。質量分析計のセットアップが完了したら、マスター電荷比範囲を1000～15,000に設定し、1秒につき1スキャンの速度で約30回のスキャンを収集します。データ収集後、適切な校正テーブルを用いて飛行時間を校正します。

キャリブレーションが完了したので、タンパク質試料をロードできます。試料は質量分析計のキャリブレーション前に調製されており、低マイクロモル濃度である必要があります。必要に応じて、遠心超ろ過デバイスを用いて試料を濃縮してください。

使用前に、タンパク質複合体がデバイスのメンブレンに吸着していないことを確認してください。容量とUV吸光度を確認するため、NESIに使用できるのは揮発性溶液のみである場合が多く、バッファー交換が必要になることがよくあります。微量遠心機用ゲルろ過カラムを使用して、塩、バッファー分子、またはその他の非揮発性付加物の痕跡をすべて除去することができます。

代わりに、サンプルを懸濁させます。酢酸アンモニウム水溶液を使用してください。この重要な工程が、スペクトルの品質を決定します。

緩衝液交換を最大3回繰り返します。その際、希釈は最小限に抑え、1デバイスあたり1.3倍未満として最大限の交換が行われるまで実施してください。濃度調整と緩衝液交換の両方が必要な場合は、本セクションの冒頭で示したように、遠心超ろ過を用いて同時に行うことができます。次に、ヨウ化セシウム較正の手順に従ってサンプルをロードし、スプレーを開始します。

まず、信号が検出されるまでスプレーの初期最適化を行います。平均電荷状態の算出には、Mを複合体の質量とする式を用います。ただし、ダルトン単位での電荷状態の正確な位置は、タンパク質によって異なります。

錯体の解離を防ぐため、鉄源を加熱しないでください。ヒーターを切るか、温度を40 degrees Celsius以下に維持してください。キャピラリーの位置、サンプリングコーンおよびエクストラクターの電圧を調整してください。

鉄の透過率を最大化するための可能な開始条件は、コーン電圧を100 V、抽出コーン電圧を1 V、キャピラリー電圧を1.5 kVとすることです。その結果、スペクトルにどのような変化が生じるかを確認してください。これらのパラメータをナノフロー圧力と組み合わせて最適化し、脱溶媒化を改善させ、残留水分および緩衝液成分を除去します。

コリジョンセルのガス圧におけるバイアス電圧を上げます。典型的なバイアス電圧は10〜100Vの範囲内であり、トラップガスの流量は1〜10 mL/minです。複合体の会合を防ぐため、この操作は慎重に行い、トラップおよびトランスファーのコリジョンエネルギーを調整してください。

高質量のイオンを伝送させるには、通常10〜30 Vの範囲のより高い電圧が必要となります。この際、ここに示すように、複合体の衝突誘起解離を避けることが重要です。安定した信号が得られた後、安定したスプレーを維持しつつ、ナノフロー圧力とキャピラリー電圧を最小値まで下げることが推奨されます。

数回のスキャンを収集した後、タンデム質量分析法によって複合体の成分の同定に進みます。タンパク質複合体について最適かつ安定した信号が得られたら、プリカーサーイオンを選択し、アイソレーション幅の質量中心を設定します。一般的に、低質量分解能は12、高質量分解能は13から15の間とし、まずは広い質量範囲を使用して高質量・低電荷の解離生成子を検出させ、その後、msを実行するために目的の値まで範囲を狭めます。

MSにより、衝突エネルギー（CE）および衝突セルの圧力を上げることで前駆体鉄を解離させます。トラップCEまたはトランスファーCEを10〜20 V刻みで徐々に増加させ、衝突ガス圧を0〜5 mL/minまで上げてください。最適な活性化条件に達するまでスペクトルの変化をモニターします。高い活性化エネルギーは、無傷の複合体から1つ以上のサブユニットの解離を誘発し、異なるサブユニット間の相互作用親和性を明確にする可能性があります。

ms MS分析のために、複数の電荷を選択してください。成分が重複している場合、一連のタンデムMSスペクトルを取得することで、異なる集団の電荷系列の解明に役立ちます。さらに、低電荷状態と比較して高電荷状態の方が解離しやすいため、MSとmsを重ね合わせて確認してください。

選択した前駆体イオンの単離を検証するためのMSスペクトル。MSおよびms/MSによる完全な複合体の特性解析に加え、穏やかな変性条件下でより小さなサブ複合体および溶液を生成し、それらの特性解析も行う。

サブコンプレックスのMSおよびms MS分析は、複合体のサブユニット構成を定義するための基礎となります。サブユニット間の相互作用を段階的に部分的に解消させるには、有機溶媒を最大50%の濃度まで徐々に添加するか、アンモニアまたはギ酸を最大4%の濃度まで添加して溶液のpHを変化させます。最終的に、複合体を構成する個々のサブユニットの質量を決定するために、変性条件下でスペクトルを取得することが重要です。これは、1%ギ酸を含む水とアセトニトリルの比率を25:75とした溶出溶媒を用い、ZipTip C4を使用して行うことができます。収集したすべてのデータを処理し、付属の書面プロトコルに詳述されている通りに結果を分析してください。タンパク質複合体サンプルを導入する前に、ヨウ化セシウムを用いて質量分析計のキャリブレーションを行います。

赤色で示された等間隔に並ぶ一連のピークは、マスター電荷比393から10,000を大きく超える広い範囲にわたっています。これらは、セシウム錯体の一般組成を持つ単価電荷の塩クラスターに割り当てられます。黒色で示された主要なピーク間にある追加のシグナルは、セシウム2価錯体およびセシウム3価錯体のシリーズである2価および3価の電荷種によって生じたものです。

高質量クラスターを検出するためには、初期真空段階の圧力を上げることが不可欠です。高質量ピークに対する圧力の影響を、1.2 millibarおよび5.3 millibarの圧力読み戻し値を用いてここで実証します。より高い圧力におけるマススペクトルを、ここでは拡大して示しています。

以下は、m/z 3,000から5,000の間に電荷状態分布を示すレクチン変異体複合体の質量分析の例です。しかし、イオンの脱塩が不十分であるため、ピークが広くなっております。バイアス電圧を4 Vから15 Vに上げ、加速条件を強化することで、残留水および緩衝液成分が除去され、高分解能のスペクトルが得られます。測定された質量は、五量体複合体に相当します。

その後、タンデムMS分析のために電荷状態+15が選択されました。衝突エネルギーの増加により、m/z 1,664を中心とする高電荷モノマーの放出と、m/z 5,000から8,000の範囲におけるストリップされた4量体複合体の放出が引き起こされます。また、レクチン変異体複合体を変性条件下で検討したところ、複合体の会合が認められました。

このようにして、複合体を構成する個々のサブユニットの正確な質量を決定することができます。ここでは、高質量イオンのMSおよびタンデムMSスペクトルを取得する方法について説明しました。この手順を行う際は、サンプルを適切に調製し、質量分析法に適合する揮発性バッファーのみを使用することが重要です。

以上です。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りいたします。