活用チック神経管の神経細胞の遺伝的に定義されたグループの軸索経路の解読卵のエレクトロポレーション

こんにちは。私はエルサレム・ヘブライ大学医学神経生物学部のDr. Review Klarの研究室のHamです。こんにちは、Sophie Esmanです。私もLarsの研究室に所属しています。今日は、in vivoでのエレクトロポレーションおよび脊髄のオープンブック標本作成の手順について説明します。

当研究室では、胚脊髄における遺伝的に定義された神経細胞集団の軸索走行を研究するために、この手順を用いています。それでは、始めていきましょう。まず、受精したホワイトレグホン鶏卵を室温から、できればロッキングトレイを備えた37から38°Cの加湿インキュベーターに移します。

生存可能で同調した胚を得るためには、インキュベーターの温度と湿度を監視することが重要です。ニワトリ胚は、エンハンサー依存的な特異的発現に最適なステージである、ハンバーガーおよびハミルトン（HH）ステージ18から20に達した時に電気穿孔されます。このステージでは、頭部が体幹に対して直角に位置しています。

また、HHステージ18から20において、前方の血管、後方の左右のバイタルライン血管などの広範な胚外血管も観察されるはずです。ニワトリ胚は孵化後66時間でHHステージ19から20に達するため、その時点でインキュベーターから卵を取り出します。卵を取り出した後、卵を水平に置き、5分から10分間待ちます。これにより、胚は卵の上極に位置することになります。

電穿孔法の前に、100 units/mLのペニシリンと0.1 mg/mLのストレプトマイシンを含むHank's溶液を調製します。2〜5 µg/µLの濃度で目的のDNA混合液を調製し、注入したDNAを容易に可視化するためにファストグリーン染料を少量加えます。また、マウスピペット、滅菌済みの注射針、小型の鋏、およびテープを用意しておきます。

ピペットプラーを用いて直径0.5 millimeterのガラスキャピラリーを延伸し、マイクロキャピラリーを作製します。タングステン電極をマイクロマニピュレーターに装着し、電極をパルスジェネレーターに接続します。パルスジェネレーターの電圧をminus 30 voltsに、パルス幅を50 millisecondsに、パルス数を3回に設定します。

胚を露出させて扱う前に、エレクトロポレーションに進みます。卵の狭極側にシリンジを挿入し、各卵から5〜6 mLのアルブミンを除去します。これは、アルブミンが漏れ出すのを防ぐために行います。

次のステップで切断する際は、小さなはさみを使用してください。雛の胚を露出させた後、卵の上側に楕円形の窓を開け、0.5から1 mLのHanks液およびペニシリン・ストレプトマイシン溶液で湿らせます。次に、マウスピペットを使用してガラスマイクロキャピラリーに液を充填します。

DNA染色剤混合液を用いて、適切な直径のマイクロキャピラリにDNAを容易に充填します。実体顕微鏡下で、神経管にDNAを注入するための胚を配置します。胚の尾側が自分の方を向くように置いてください。

この発達段階では、脊髄が鮮明に視認できるため、コントラストを付けるための手法は必要ありません。脊髄は頭側と尾側の両端で密閉されています。しかし、マイクロキャピラリーで穿刺する際は、神経管により多くの穴を開け、浅い角度で貫通させます。十分に細く、適切な直径のマイクロキャピラリーを使用すれば、神経管を損傷させることなく貫通させることができます。

マウスピペットを用いてDNAを注入します。適切な直径のマイクロキャピラリーを使用し、規則的な呼気でDNAを放出させてください。緑色の色素が尾の先端から発達中の脳の脳室まで広がるはずです。

神経管がDNAで満たされるまで注入します。注入したDNAを細胞内に導入するには、電気穿孔法が必要です。まず、電極を神経管と平行に、かつ神経管自体に触れない限り限り近接して配置します。パルス発生時に電気伝導性を確保するため、電極が液体に浸っていることを確認してください。

通常は、胚を露出させた直後に添加したHank液で十分です。しかし、不十分な場合は、電極を配置して液体に浸した状態で、パルスを加える直前にHank液を1滴加え、電気穿孔を行います。その後、電極を慎重に取り除き、窓と卵をテープで密封します。その後の培養期間中に胚が乾燥するのを防ぐため、卵を完全に密封することが重要です。

卵をインキュベーターに戻し、雛胚が胚発生6日目（E6）に達するまで培養します。エレクトロポレーションを行った胚が胚発生6日目（E6）に達し、イメージングの時期（エレクトロポレーションの3日後）になったら、細いハサミを用いて卵から取り出し、PBSを入れたシリコンコーティング済みのペトリ皿に配置します。

膜を取り除き、胚の腹側を伸ばして、シリコンに刺したピンで固定します。鋭いタングステン製マイクロキャピラリーを用い、後脳から尾側にかけて、 roof plate に沿って縦方向に切開します。

脊髄の両側にさらに2本の縦切開を加え、後根神経節（DRG）を脊髄から切り離します。尾側から後脳に向かって床板を組織から切り離し、脊髄はそのまま残します。最後に、微細剪刀を用いて後脳の位置で脊髄を横断的に切断し、脊髄を体から分離します。

脊髄を分離したので、PBSを入れた新しいシリコンコーティング済みのペトリ皿に広げ、後脳から尾端までピンで固定して、フラットマウント標本を作成します。脊髄を4%パラホルムアルデヒド含有PBS中で室温で1時間固定し、脊髄を展いた状態でマウントするための、詳細な付随書面プロトコルに従って免疫染色を行います。その後、イメージングのための標本作成を行います。

スライド上にグリースまたはシリコンを長方形に塗り、その長方形の内側にPBSを滴下します。ピンセットを用いて、脊髄を長方形の中央に伸ばすように配置し、周囲の液体を吸い取ります。パスツールピペットを使用して封入剤を脊髄の上に1〜2滴滴下し、カバーガラスで覆います。

カバーガラスに圧力をかけます。気泡が入らないようにしてください。スライドは4 °Cの暗所で保存します。

共焦点顕微鏡を用いて脊髄を観察します。ここでは、CMV由来の遍在性エンハンサーエレメントを利用してすべてのニューロンにRFPを発現させた対照実験における、ニワトリ脊髄介在ニューロンの軸索投射の代表的な結果を示します。ほとんどのニューロンとその軸索が標識されているため、ニューロン亜集団の軸索経路を判別することは不可能です。

しかし、特定の増強因子を適用すると、この例では特定のサブポピュレーションであるDI2ニューロンの明確な軸索経路が明らかになります。以上で、E3における特定のニューロン増強因子を用いた鶏神経管の電導入方法と、E6における脊髄のオープンブック標本の作製方法について説明しました。この手順を行う際は、慎重かつ根気強く取り組むことが重要です。

以上となります。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りしております。それでは、頑張ってください。