ヘリオス遺伝子銃を用いたタマネギの細胞における蛋白質 - 蛋白質相互作用のための二分子蛍光相補（BiFC）アッセイ

この手順では、2つのシロイヌナズナ転写調節因子であるSEU（SEUS）とLUH（LUHOLOG）の間のin vivoにおけるタンパク質間相互作用を検証します。バイオ分子蛍光相補法を利用し、SEUを黄色蛍光タンパク質（YFP）のN末端断片に、LUHをYFP DNAのC末端断片にそれぞれ融合させ、2つのプラスミド構築物を作成します。これらのSEU-NYFPおよびLUH-CYFPをタマネギ表皮細胞に粒子銃法で導入し、相互作用を検証します。

SeussとLUHの相互作用により、核内でYFPの末端フラグメントとC末端フラグメントが結合し、核内でYFP蛍光が誘導されます。暗所で16から20時間インキュベートした後、蛍光顕微鏡下でタマネギ表皮剥離組織を観察し、蛍光を可視化します。こんにちは、メリーランド大学細胞生物学・分子遺伝学部、Zhi Lu博士の研究室のCourtney Hollanderです。

本日は、BioRad Helios जीनガンを用いてタマネギ細胞でタンパク質間相互作用を検証する手順について解説します。当研究室では、植物細胞におけるタンパク質間相互作用およびタンパク質の局在を検証するためにこの手法を用いています。それでは始めましょう。

本手順を開始するにあたり、WoodsおよびZeto（2008年）によるJoVEプロトコルに従ってHelios遺伝子銃用のカートリッジを調製します。当該プロトコルでは、各カートリッジの調製手順が詳細に示されています。BIFC用として、50 µgの全プラズミドDNAを12.5 mgの金粒子および0.5 mg/mLのPVP溶液と混合します。同様のカートリッジ調製法を用いて、相互作用すると推定される2つのタンパク質のプラズミドDNA、すなわちYFPのN末端半分に融合させたSeuss（略称：seus-NYFP）と、YFPのC末端半分に融合させたLU Homolog（略称：L-U-H-C-Y-F-P）を調製します。

合計量は1回あたり50 µgであり、1カートリッジにつき0.25 mgの金に対し1 µgのDNAという条件で最大50個のカートリッジを作成できます。各カートリッジは1回限りの使用となります。カートリッジの調製後、金粒子が効率的に射出されるかを確認するためにテストを行ってください。

パラフィルムの正方形の断片でペトリ皿を包みます。次に、ヘリウム圧力を150から200 PSIの間に設定し、新しく作成したカートリッジをパラフィルムの正方形に向かって発射します。パラフィルム上に淡い金粒子が観察されることを確認してください。

ヘリウム圧力が異なると、パーフィン上に飛散する金粒子の量が変わる場合があります。ただし、有意な差がない場合は、低圧側でボンバードメントを行ってください。また、このテストによって、1回のショットでカバーされる領域を確認することができます。

タマネギ組織を準備するために、清潔で鋭利なカミソリを使用して、大きな黄タマネギの外皮を剥きます。2×8 cmの長方形の領域を、4～5層の深さまで切り出します。切り出した長方形のタマネギ組織を取り出し、外側の2層を廃棄します。

タマネギの残りの層を、約1.5 cm四方の断片に切り分けます。3 mmのフィルターペーパーの円形切り抜きを入れたペトリ皿に、タマネギの断片を置きます。滅菌水で湿らせ、ペトリ皿に蓋をします。

タマネギの断片が粒子銃による処理（ボンバードメント）の準備に整いました。まず、白い円形のカートリッジホルダーにカートリッジを装填します。異なるプラスミド構築物を含むカートリッジを、それぞれ別のカートリッジホルダーに装填してください。各カートリッジホルダーには最大12本のカートリッジを装填でき、12回のショットが可能です。

ここでは3種類の異なるホルダーをロードしています。最初のホルダーには、カリフラワーモザイクウイルス由来の強力かつ構成的なプロモーターである35 S-G-F-P-Aを含むカートリッジが入っています。このプラスミドは陽性対照として使用されます。

2番目のホルダーには、同量のS-E-U-N-Y-F-PとL-U-H-C-Y-F-Pを含む実験用カートリッジを装填します。3番目のカートリッジホルダーには、puck spineベクターとLUH puck spiceを等モルで混合したカートリッジを装填します。これはネガティブコントロールとしても機能します。

バッテリーと新しいバレルライナーをHeliosジーンガンに挿入します。バレルライナーとガンの両方に、それぞれのOリングが装着されていることを確認してください。次に、カートリッジホルダーの番号12のマークがガンの上側を向くようにして、空のカートリッジホルダーをジーンガンに挿入します。

カートリッジホルダーを1〜2回進めて、正しく挿入されていることを確認します。次に、ガンをヘリウムタンクに取り付け、圧力を150〜200 PSIに調整します。耳栓などの聴覚保護具を着用し、サイドボタンを押しながらトリガーを引いて、数回テスト射撃を行います。カートリッジホルダーが空の状態で射撃することで、ガンチャンバー内が洗浄され、圧力が安定します。

DNAを射出する前に、タマネギの断片を射出することで、背景蛍光のネガティブコントロールとすることができます。DNAをコーティングした金粒子を射出するには、空のカートリッジホルダーを取り外し、ポジティブコントロールが入った最初の充填済みカートリッジホルダーを挿入します。カートリッジホルダーを進め、射出予定のカートリッジがカートリッジホルダーの底部に位置するようにします。

次に、タマネギの断片を空のペトリ皿の中央に置き、タマネギの最も内側の層を上に向けます。ジーンガンのバレルライナーをペトリ皿に密着させ、発射します。次のカートリッジに進み、別のタマネギ断片に対して射撃を行います。

タマネギの断片を4〜5個射撃するまで、この手順を繰り返します。各タマネギ断片は、射撃後に一度だけ射撃されます。射撃したタマネギ断片を、実験用カートリッジを射撃するための、湿らせた3 mmフィルターペーパーを含むペトリ皿に移します。

カートリッジをHoldenに変更します。2点目に、コンタミネーションを防ぐため、バレルライナーを交換することを忘れないでください。陽性対照として、先ほど示したように、タマネギの断片を4〜5個ショットします。

次に、陰性対照DNAを含むカートリッジHoldenの3番に交換します。そして、再び4〜5個のタマネギ片を注入します。

汚染を防ぐため、バレルライナーを交換します。照射後、タマネギ片が入ったペトリ皿に蓋をします。

乾燥を防ぐため、パラフィルムで包みます。タマネギの断片を室温、暗所で16〜48時間インキュベートします。粒子銃による導入が完了したら、ガスを遮断して圧力を解放してから、ヘリウムタンクから粒子銃を取り外します。その後、バレルライナーを緩めて、カートリッジホルダーと使用済みのカートリッジを取り出します。

最後に、カートリッジホルダーとバレルライナーを石鹸水の入ったビーカーに浸し、超音波洗浄します。20分間洗浄してください。その後、水ですすいで石鹸残渣をすべて取り除きます。

70% ethanolに1時間浸した後、ペーパータオルで乾燥させます。粒子銃照射から16〜20時間後にタマネギ片の観察を行います。照射したタマネギ片を室温で16〜20時間培養した後、平先のピンセットを使用して、タマネギの内表皮から単層の細胞層をゆっくりと剥離します。

これは、爆撃時に銃に直接面する層です。剥離させた層を、スライドカバー上の水滴の上に置き、カバーガラスで覆います。その際、気泡が入らないように注意してください。

ここに示されているZEISS Axio Observer Point Z1などの蛍光顕微鏡を用い、顕微鏡の明視野下でGFPまたはYFPの蛍光を観察します。まず、細胞が生存していることを確認するために、細胞質流動を確認します。その手順は以下の通りです。

スライドを数分間明視野光にさらし、タマネギ組織を温めた後、プラスミドの移動を確認します。細胞質流動は必ずしも容易に観察できるとは限りませんので、はっきりと見えなくても落胆しないでください。蛍光検出には、GFPまたはYFPに適した励起フィルターおよび検出フィルターを使用してください。また、非蛍光プラスミドを導入したタマネギ片であるネガティブコントロールについても確認してください。

損傷した細胞やデブリ、およびタマネギから、かすかな黄色信号が現れることがあります。また、陽性対照を確認してください。これは、構成的に発現する蛍光レポーターを含むプラスミドです。

GFP蛍光は一部の細胞で確認されますが、すべての細胞で見られるわけではありません。また、気泡によって背景蛍光が生じることがあります。タマネギ表皮細胞からGFP信号が確認できれば、カートリッジ、タマネギ組織、およびジーンガンの射撃が適切に準備および実行されたことを示します。

ここでは、35 SGFP陽性プラスミドから観察される強い蛍光を示しています。強い蛍光は、核と細胞質の両方を含む細胞全体に見られます。明視野像により、対応する細胞と核の輪郭を確認することができます。

すべての細胞が形質転換されるわけではありません。Seuss、NYFP、およびL-U-H-C-Y-F-Pの実験的な組み合わせをタマネギ細胞に粒子銃法で導入すると、タマネギ細胞の核にYFP蛍光シグナルが検出され、Seuss NYFPとL-U-H-C-Y-F-Pがin vivoで相互作用することが示されました。しかし、この相互作用に起因する蛍光は、陽性対照である35 SGFPによる蛍光よりも著しく弱くなっています。

さらに、SEUSおよびLUH転写因子は核に局在しています。したがって、YFP蛍光は核内でのみ観察されます。また、蛍光細胞の数は、35 SGFPポジティブコントロールの数よりも有意に少なくなります。

これは、BiFCが、パートナーとなる両方のプラスミドが同一のタマネギ細胞内で発現した場合にのみ機能するためです。陰性対照として予想される通り、puck spine、ベクター、およびL-U-H-C-Y-F-Pの混合物を含むカートリッジホルダー3で bombarded されたタマネギでは、蛍光シグナルは検出されません。以上で、BioRad Helios 遺伝子銃システムを用いて、タンパク質間相互作用をテストするためのタマネギ細胞への bombarded 方法を説明しました。

この手順を行う際は、適切なポジティブコントロールおよびネガティブコントロールを使用することが重要である点に注意してください。また、BIFCの蛍光はシグナルが弱くなる可能性があり、蛍光を発する細胞数も少なくなる可能性があることを念頭に置いてください。以上です。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りいたします。