タバコプロトプラストと葉で二分子蛍光相補性によって可視化し、タンパク質間相互作用

次の実験の全体的な目標は、無傷のタバコの葉で発現する2つのタンパク質の相互作用を監視することです。これは、適切なコンストラクトを設計し、目的の2つの遺伝子を融合して蛍光タンパク質を分割し、これらのコンストラクトをアグロバクテリアに変換することによって達成されます。第2のステップとして、アグロバクテリアの培養物を混合してタバコの葉に注入すると、タンパク質の発現と再構成された蛍光シグナルが得られます。

タンパク質が近接している場合は、次に、葉全体または単離されたプロトプラストを顕微鏡で分析します。蛍光顕微鏡で検出される放出された蛍光シグナルに基づくタンパク質タンパク質の相互作用を示す結果が得られます。cor免疫沈降法や酵母からハイブリッドへの既存の方法のこの技術の主な利点は、タンパク質タンパク質の相互作用を生きた植物細胞で直接監視できることです。

この方法は、さまざまな細胞コンパートメントでのタンパク質複合体の形成など、植物生物学分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この手順を開始するには、タバコの葉の変換に使用するアグロバクテリアを成長させます。適切な抗生物質を含む10ミリリットルのLB培地に、目的のプラスミドを含む50マイクロリットルのAG L1グリセロールストック培養液を滅菌50ミリリットルチューブに接種します。

摂氏28度で少なくとも24時間インキュベートし、190 RPMで振とうし、翌日に培養物がOD 600から1.0の間で2.0に達するまで。細菌をGの3000倍で15分間遠心分離します。上清を捨てた後、新たに作った浸透媒体にペレットを懸濁し、懸濁液をOD6001の1.0に調整します。

アグロバクテリア細胞をオーバーヘッドシェーカーで室温の暗闇で2時間インキュベートし、タバコの葉に浸潤させます。生後3週間のタバコ植物からいくつかの古い葉を選びます。等量を混ぜます。

目的の構造を運ぶアグロバクテリアのそれぞれ3ミリリットル。針なしで5ミリリットルのシリンジに細胞懸濁液混合物を充填し、細胞懸濁液をタバコの葉に浸潤させます。葉の底側にある注射器を数か所で慎重に押し、植物に水をやり、2日間それらを覆って光から保護します。

浸潤した葉からプロトプラストを分離するには、まず、葉をペトリ皿に入れ、新たに調製した酵素溶液を加えます。新しいカミソリの刃を使用して、葉を約0.5平方センチメートルのサイズに切ります。次に、酵素溶液を入れた葉片を真空に移します。

潜入フラスコ。葉から気泡が出るまで、約20秒間真空に浸潤します。掃除機を非常に慎重に解放します。

フラスコを90分後に室温の暗闇で40RPMで90分間振とうします。90 RPMで1分間振とうして、プロトプラストを放出します。ガーゼで溶液をろ過し、15ミリリットルの丸底遠心チューブに入れます。

プロトプラスト溶液を2ミリリットルのFPCNバッファーで覆い、室温でゆっくりと加速および減速しながら、Gの70倍で10分間遠心分離します。無傷のプロトプラストは、広いオリフィス1ミリリットルのピペットチップを使用して酵素溶液とFPCNの間の界面に蓄積し、無傷のプロトプラストを新しい遠心分離チューブに移します。この手順を成功させるには、無傷のプロトプラストの破裂を防ぐために、常に白いオリフィスチップを使用してください。

チューブにW 5バッファー遠心分離機を充填し、Gの100倍で2分間、ゆっくりと加速および減速します。プロトプラストをペレット化するには、上清を慎重に取り除き、ペレットを再懸濁します。約200マイクロリットルのWで、プロトプラストの量に応じて、5つの緩衝液

レーザー走査型顕微鏡用のプロトプラストサンプルを最初のペースで調製するには、顕微鏡スライド上に約2cm間隔でシーラントの2つの小さなストリップを置きます。ストリップの間に20マイクロリットルのプロトプラスト溶液を置き、カバーガラスを慎重に上に置きます。シーラントストリップは、プロトプラストがカバーガラスによって押しつぶされるのを防ぎます。

レーザー走査型顕微鏡用の全葉サンプルを調製するには、葉から1cmのピースを切り取り、葉の底面を上に向けて顕微鏡スライドに置きます。約30マイクロリットルの水を追加します。上にカバーガラスを敷き、両面を粘着テープでしっかりと固定します。

イメージングは、MICCAタイプTCS SP fiveの共焦点レーザー走査型顕微鏡で拡大して行います。グリセロールをイメージング媒体として、等級63倍の対物レンズを使用し、評価にはライカアプリケーションスイートの高度な蛍光ソフトウェアを使用します。アルゴンヌレーザーを30%に設定し、レーザー出力を488ナノメートルに18%の強度に設定します515ナノメートルで信号を監視するには、最初のPMT検出器の発光帯域幅を495〜550ナノメートルに設定します。

クロロフィル自家蛍光をモニターします。2 番目の PMT 検出器の発光帯域幅を 650 ナノメートルから 705 ナノメートルに設定します。M cherry 信号を監視するには、HENI 5 61 レーザーを使用します。

レーザーの強度を18%に設定し、3番目のPMT検出器の発光帯域幅を587〜610ナノメートルに設定します。すべてのPMT検出器チャンネルからの写真が同じゲイン設定で撮影されていることを確認してください。ゲインは、バックグラウンド信号を除外するために800〜900である必要があります。

この形式で、幅と高さが 1024 x 1024 ピクセルで、スキャン速度が 100 ヘルツの画像を取得します。Zスタッキングの場合、各スタック間の最大距離は0.5ミクロンです。この研究では、BFC法を使用して、細胞質分子シャペロンHSP 90と膜ドッキングタンパク質TPR 7およびTPR 64との相互作用をモニターしました。

この図に示すように、金星は、小胞体に存在するTPR7または葉緑体外包に存在するTPR7の細胞質部分に結合しています。Hs.P 90は、N末端にSCFPに融合しており、トーク64とTPR 7のTPRドメインの相互作用を可能にしています。HSP 90 C、Terminusでは、SCFPのみがネガティブコントロールとしてサイトゾルで発現され、TPR 7 HS P 90タンパク質複合体の局在性を検証します。TPR セブンとHS P 90は、ERマーカーで共変換されました。

蛍光は、対照として無傷の葉でモニターしました。SCFP単独は、TPRセブンおよびERマーカーと共に発現した。表示されているすべての画像で、スケール バーは 10 ミクロンを表しています。

左のパネルは、515ナノメートルでモニターされた緑色で再構成された蛍光を示しています。ERマーカーは赤で表示されます。中央のパネルでは、両方の信号のオーバーレイが右側のパネルに表示されます。

TPR 7とHS P 90の再構成された信号を、黄色で表示されているERマーカーと重なってモニターしました。対照的に、TPR 7の信号はなく、CFPとしてのネガティブコントロールは監視されました。次の例では、葉緑体タンパク質tox 64をHS P 90とコントロールとして共発現させた。

Tox 64はSCFP単独と共発現しました。前回と同様に、緑色で再構成された蛍光を515ナノメートルでモニターしました。中央のパネルは、480ナノメートルでモニターされたクロロフィル自家蛍光を示しています。

右側のパネルには、両方の信号の赤いオーバーレイが表示されています。再構成された蛍光は、tox 64およびHSP 90を発現するcoex細胞で観察されましたが、細胞では観察されませんでした。tox 64とSCFPのみの発現をするCoex。

tox 64とHSP 90の正確な局在は、葉全体の顕微鏡写真で決定するのが難しいためです。プロトプラストは、蛍光顕微鏡法のために浸潤したタバコの葉から単離されました。前回と同様に、再構成された蛍光を515ナノメートルで監視し、クロロフィル自家蛍光を480ナノメートルで監視し、この重ね合わせ画像に示すようにオーバーレイ画像を作成し、64とHSP90を葉緑体を取り囲むリング状構造として検出できる。

このビデオを見れば、コンストラクトの設計方法、タバコの葉の形質転換方法、および目的の2つのタンパク質の相互作用を示す蛍光シグナルの最適な視覚化方法を十分に理解できるはずです。