二分子蛍光相補

本実験の目的は、細胞内で2つのタンパク質が相互作用するかどうかを定義し、その相互作用部位の特性を明らかにすることです。まず、目的とする2つのタンパク質をコードする発現コンストラクトを細胞にトランスフェクションします。この際、一方のタンパク質は断片化蛍光タンパク質のN末端に、もう一方は相補的なC末端に融合させます。トランスフェクションした細胞を培養し、蛍光シグナルを発現させた後、イメージングおよびイムノブロッティングによってタンパク質複合体を可視化します。

次に、収集した画像をImage Jなどの解析ソフトにエクスポートします。制御された実験において、細胞あたりの平均蛍光強度を定量化するため、BIFCの結果を用いてタンパク質間相互作用およびこれらの複合体の局在を実証することが可能です。例えば、足場タンパク質のSH3ドメインとPI3K$\text{p}110\beta$のプロリンリッチドメインの相互作用などが挙げられます。共局在、免疫共沈降、FRETなどの既存の手法に対する本手法の主な利点は、BFCを用いることで、細胞内における弱く一過性の相互作用を空間的に局在化できる点にあります。また、この方法はFRETで見られるような大規模な画像後処理を必要としません。

この手法を用いることで、タンパク質XとYが相互作用するか、また相互作用する場合、それらの複合体が細胞内のどの特定のコンパートメントに局在するかといった、シグナル伝達領域における重要な疑問を解決できます。一般的に、この手法を初めて行う方は、バイオセンサーの発現に適した構成を選択できていないため、苦労することがあります。まず、BIFC融合タンパク質に使用する複数の蛍光タンパク質の中から1つを選択し、目的のタグ付きタンパク質を決定します。

Venusのアミノ末端とカルボキシ末端は37 °Cで複合体を形成できる一方で、Y-F-P-B-I-F-Cフラグメントは30 °Cでの事前インキュベーションが必要であることを考慮してください。BIFCフラグメントの付加が目的タンパク質の機能にどのような影響を与えるかを検討し、タグ付加のための発現ベクターを設計してください。例えば、RAsファミリーやGTP αはカルボキシ末端で脂質修飾を受けているため、この修飾を損なわずに同末端にタグを付加することはできません。

トランスフェクション条件を決定するために、必ずパイロット実験を行ってください。また、蛍光顕微鏡で細胞を観察し、シグナルが十分に現れる最適な時間を特定してください。その後、ウェスタンブロット解析を行い、構築物が均等に発現していることを確認してください。

重要な点として、各サンプルプレートにおいて、BIFCフラグメントの添加が目的タンパク質の細胞内局在を変化させていないことを確認するため、HAタグまたはFlagタグの免疫染色を行ってください。1.3 × 10⁵ 個の細胞を、ガラスボトムプレート1枚および6ウェルプレートの2ウェルにそれぞれ播種し、37 °Cのインキュベーターで一晩静置して細胞を定着させます。翌日、リポフェクションまたはその他の好ましい方法を用いて、トランスフェクション用のDNAを調製します。

まず、トランスフェクションコントロールとして、DNAを250 µLの無血清DMEMで希釈します。CFPを、全BIFC DNA量の50分の1の量で添加します。次に、DNA 1 µgあたり10 µLのリポフェクション試薬を用いて、リポフェクション試薬を250 µLの無血清DMEMで希釈します。

DNAとリポソーム希釈液を混合し、室温で20分間インキュベートします。温めた無血清DMEMで細胞を2回洗浄します。ガラスボトムプレートまたは6ウェルディッシュの各ウェルに、無血清DMEMを2 mL加えます。

次に、各トランスフェクション混合液を、ガラスボトムディッシュ1枚と6ウェルプレートの2ウェルに均等に分注し、細胞を37 °Cで5時間インキュベートします。最後に、トランスフェクション培地を除去し、10% FBS添加完全DMEM培地に交換します。

目的タンパク質の必要な発現レベルを得るために、予備実験で決定した時間、細胞をインキュベートします。エピ蛍光顕微鏡で導入細胞を観察し、ポジティブコントロールに蛍光が認められることを確認します。ライブセルイメージングに備え、PBSで細胞を3回洗浄します。

細胞を指標色素を含まない培地に置きます。固定細胞をイメージングする場合は、2%パラホルムアルデヒドを加え、氷上で10分間静置します。

次に、細胞をPBSで3回洗浄し、1 mLのPBSで満たした後、4°Cの暗所で保存し、直ちに6ウェルプレート内の細胞を溶解します。ウェスタンブロット解析では、溶解細胞が画像撮影した細胞を代表するものであるように、すべての細胞を同時に調製することが重要です。タグタンパク質が同レベルで発現していることを確認するために、ウェスタンブロットを実施してください。

共焦点顕微鏡を用いて細胞をイメージングする際は、サンプル間で蛍光強度を比較できるよう、実験全体を通して設定を一定に保つことが重要です。ピクセルが飽和していない個々の細胞を確実にイメージングしてください。CFPをトランスフェクションコントロールとして導入しているため、BIFCシグナルの解析にはCFP陽性細胞のみを選択してください。

Image Jなどのイメージングソフトを用いて蛍光強度を定量します。Image Jで画像ファイルを開きます。[Analyze]から[Set Measurements]を選択します。測定項目のボックス内で、[Area]（面積）と[Mean Gray Value]（平均輝度値）にチェックを入れます。なお、本例では静脈画像が擬似カラーの緑色に、CFP画像が擬似カラーの赤色に色付けされています。

自由形式選択ツールを使用して、CFPチャネルで細胞全体の縁に沿ってアウトラインを描き、そのままにしておきます。YFPチャネルに切り替えます。「解析（analyze）」に移動し、平均グレー値を測定します。これにより、各画像の細胞あたりの平均蛍光強度が算出されます。

細胞を含まない領域に、YFPチャンネルで円を描きます。この領域をバックグラウンドとして測定してください。各画像からこのバックグラウンドを減算します。

最後に、細胞集団の平均蛍光強度を算出するため、1つのサンプルでイメージングしたすべての細胞について、平均グレー値からバックグラウンドを差し引いた値の平均を求めます。理想的には、3回の実験にわたって60個の細胞を定量してください。マルチドメイン足場タンパク質intersectinは、新規のクラスII PI 3-kinaseであるPI3KC2βの調節を通じて神経細胞の生存を制御します。intersectinのSH3ドメインはPI3KC2βのアミノ末端プロリンリッチ領域と相互作用します。VNタグ付きintersectinとVCタグ付きPI3KC2βを共導入すると、YFPチャネルに蛍光信号が得られ、これを擬似的に緑色に彩色することで複合体形成を示しています。

ここで赤色に擬似着色されているCFPは、形質導入された細胞を標識するためのコントロールとして使用されています。PI3K2βのプロリンリッチドメインにおける変異は、intersectinとPI3K2βの共沈殿を阻害し、BIFC信号を減少させます。このBIFC信号の差は、野生型と変異型PI3Kタンパク質の発現量の差によるものではありません。この手法に習熟すれば、適切に行うことで3日間で完了させることができます。本手順を実施する際は、適切なコントロールを走らせ、タンパク質の発現を確認し、BIFC信号の差が発現量の差ではなく、複合体形成の差に起因することを確実にしてください。

これらの複合体がお互いに対してどのような異なる親和性を持つかという疑問に答えるために、レジデントに対する表面プラズモン共鳴などの他の手法を実施することができます。