分岐点間での樹の統合を調査するためにデジタルマイクロミラーデバイスと模様の光刺激

この手順の全体的な目的は、ニューロンを刺激するために、時間的および空間的に複雑な光パターンを制御することです。これはまず、顕微鏡の光路において、DMDチップを適切な共役像面に配置することによって達成されます。手順の第2ステップは、レーザーなどの強力な光源を用いてDMDを適切に照射することです。

手順の第3ステップは、コヒーレント照明によるスペックル現象を除去することです。手順の最終ステップは、DMDチップを操作するためのグラフィカルユーザーインターフェースを統合することです。最終的に、DMDシステムを用いたケージド神経伝達物質のマルチサイト光分解により、従来は困難であった実験が比較的容易に達成できることが示されます。

こんにちは。メリーランド大学神経科学科のDr. Chaman Tangの研究室に所属しているMichael Mohammedです。今日は、光学顕微鏡を用いて複雑な消去パターンを生成する手順についてご紹介します。当研究室では、樹状突起の統合を研究するためにこの手法を用いています。

それでは、開始しましょう。このプロトコールでは、実験神経科学に用いられるデジタルマイクロミラーデバイス（DMD）照明システムの操作方法を説明します。DMDとは、表面に数十万個の微小な可動ミラーが矩形に配列された光学半導体チップであり、各ミラーの位置が画像のピクセルに対応しています。

各ミラーは、2つの方向の間で個別に傾斜制御が可能です。オフの状態では、光は試料照明の光軸から外れる方向に導かれます。オンの状態では、光は光軸に沿って導かれます。

DMDは、非常に強力なUV光に耐性があり、オンとオフのピクセル間で高いコントラスト比を生成でき、さらに2つの状態を数十マイクロ秒で切り替えられるため、溶菌に非常に適しています。バイオ医学研究へのDMDの応用は、画像操作ソフトウェアおよびハードウェアが広く普及していることや、画像表示分野における商業的な関心によって促進されています。モジュール式コンポーネントは、Texas Instruments社からDLPディスカバリーキットとして販売されており、これらはDMDを顕微鏡システムに適応させるための支援電子ドライバーを提供しています。

顕微鏡光学に関する基本概念を理解する必要があります。現代の基本的な蛍光顕微鏡は、結像光路と照明光路で構成されています。これは、対物レンズ、フィルターキューブ、および結像光路と照明光路のための2つの独立したチューブレンズによって構成されています。

この顕微鏡は、試料像面に共役な位置を持つように設計されており、試料面で焦点が合っている物体は、これらの共役像面でも焦点が合って見えます。この概念から導き出される結論として、共役像面で生成された明るい像は、試料像面上にも鮮明に投影されることになります。この手法を用いて、コンピュータで生成した照明パターンを試料上に投影します。

レーザービームは非常に明るい光源として機能し、共役像面に配置されたDMDチップ上のマイクロミラーによって実装されたパターンを照射します。DMD照明システムの設計は、可視光波長の光を利用する光遺伝学実験に使用される励起光に依存します。照射されたパターンは、カメラパスを通じて導入することが可能です。

したがって、DMDチップはデュアルカメラポートモジュールの2つのカメラポートのいずれかに簡単に取り付けることができます。逆に、ケージ化合物の光分解など、UV領域の光を使用する実験では、光をエピ照明経路に導入し、よりアクセスしやすい共役像面を作成する必要があります。これは、結像チューブレンズがUV透過用に設計されていないためです。

その代わりに、照明結像レンズをUV透過に利用し、画像形成において十分な役割を果たさせています。DMD上の各マイクロミラーは、チップの平面に対してプラスまたはマイナスの12度の傾斜を切り替えることができます。コンピュータからのデジタル入力に応じて、回転軸は各ミラーの対角線方向に設定されており、これはチップの矩形辺に対して45度の角度になります。

ミラーの傾斜方向は、チップ表面のコーナーにある金色の三角形で示されています。マイクロミラーの傾斜により、入射照明ビームのピッチと方位の調整が決まります。DMDを照明するには、まず照明ビームのピッチをDMDチップの垂直軸から24度に設定し、方位をミラー回転軸に対して垂直に設定します。

効率的な動作のためには、精密なビームアライメントが極めて重要です。溶菌実験では、迅速なアンケージングに必要な高強度の集束ビームを生成するために、レーザー光源を使用してください。

ここでは、準連続波ダイオード励起固体波長変換（3倍波）Nd:YAGレーザーを使用します。レーザー出力のごく一部しか実際に試料に到達しないため、比較的高出力のレーザーを使用してください。DMDシステムを使用する場合は、レーザー出力をマルチモードファイバーに導入し、DMDを照明するための適切な軸に沿って容易に配置および方向調整ができるようにして、コヒーレント照明によって生じるスペックル問題を解決します。光を光ファイバー経由で透過させてください。

ファイバーは、約40 kilohertzで振動するように駆動されるピエゾ電気ファイバーストレッチャーに巻き付けられています。ファイバーを微細に伸長させることで、各光刺激パルスのミリ秒単位の持続時間中にスペックルパターンを何度も移動させることができ、これによりスペックルを効果的に除去しています。最後に、光ファイバーの出力をUV顕微鏡対物レンズでコリメートしてDMDを照射し、CCDピクセルをDMD画像ソフトウェアとコアジストさせました。このソフトウェアは、個々のDMDミラーをイメージングCCDカメラの特定のピクセルに対応させるために作成されました。

ソフトウェア内のグラフィカルユーザーインターフェースにより、ユーザーはコンピュータマウスを使用して、CCD画像上の領域に対応するDMDミラーの配向を割り当てることができます。コンピュータ画面に表示された画像上でカーソルを動かして光刺激の位置を指定し、タグ付けされた関心領域をクリックして、光照射パターンの保存をプログラムします。コンピュータ画面上に一連の独立した画像としてマークされたパターンにより、各空間パターンのためのレーザーパルスのタイミングがソフトウェアにプログラムされます。

これはデータ収集プログラムであるP clampと統合されます。最後に、データ収集プログラムを使用して、DMD電子回路のタイミング、レーザーのゲーティング、および標的ニューロンからのパッチクランプ電気信号の収集を同期させます。ここでは、光学系分解能のキャリブレーションを示しています。

蛍光標的を用いて測定した最小スポットサイズを示します。有効な生理学的解像度は、光刺激の関数として電流流量の振幅により測定されます。スポット位置については、直径2 µmの樹状突起分枝に隣接してケージドグルタミン酸を光分解しました。

スポットを移動させた。光刺激の強度を変えて、ダイオードを直交するように走査した際の電気的応答を示す。光強度に対する電位固定応答を図示している。

DMDベースのシステムを用いることで、分散的な樹状突起刺激を容易に実装できます。ここでは、2本の樹状突起枝上の円で示された光刺激スポットの数を増やすことにより、入力強度を変化させました。空間的加算は、分岐点において非線形になる可能性があります。

2つのドアブランチに到達する入力振幅が増大するにつれて、超線形性がますます強まります。これらの結果は、樹状突起の分岐点における加算が非線形に行われることを明確に示しています。この超線形性は、電位依存性チャネルではなく、主にNMDA受容体によって媒介されています。

これは、2つのNMDA受容体拮抗薬であるAPVとMK 8 0 1を適用することで、非線形挙動が大幅に消失することから実証できます。以上で、神経組織のパターン光刺激に用いるDMDベースのシステムの基本的な設計と動作について説明しました。このシステムは、光遺伝学実験などで使用される可視光による刺激にも適応させることが可能です。

また、単光子溶解に使用される近紫外光にも適応可能です。この手順を行う際は、波長400 nanometers未満の光を使用し、多くの場合にエピ照明経路を通す場合、照明ビームを数度以内の精度で正確に整合させることが極めて重要であること、およびコヒーレント光を使用する場合はスペックルを効果的に除去する必要があることを念頭に置いてください。以上です。

ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りいたします。