胚形成の間に機能的な冗長性をテストするための逆遺伝学的アプローチ

この手順の全体的な目的は、特定の細胞系譜の決定において、2つの遺伝子が機能的に冗長であるかどうかを判定することです。これは、まず、発生中のゼブラフィッシュ胚に遺伝子特異的なモルフォリノを注入し、個々の遺伝子の機能喪失表現型を定義することで達成されます。この手順の第2ステップは、細胞系譜の決定または分化を定量化するためのアッセイを構築することです。

例えば、本稿で示すように、レポーター魚株を使用します。手順の第3ステップは、2つのモルフォFENOを組み合わせて、2つの遺伝子の機能喪失を同時に標的とすることです。手順の最終ステップは、ダブルノックダウンによって引き起こされる表現型を評価することです。

最終的に、リネージレポーターの確認やリネージ特異的マーカーの発現解析を通じて、特定の系統の細胞における機能喪失または機能獲得を示す結果を得ることができます。マウスモデルでのノックアウトの組み合わせのような既存の手法に対する本手法の主な利点は、検証済みのモルフォリノを単一の実験で組み合わせるだけで、魚類モデルにおいて2つ、あるいは3つの遺伝子までも標的にできる点にあります。100個以上の胚に注入を行い、数日間にわたって表現型を評価することが可能です。

この手法は、重要な疑問の解明に役立ちます。細胞運命を制御する転写経路の定義などの発生生物学において、主要な調節経路は、機能的に冗長な関連遺伝子の小さなファミリーによって構成されていることが多くあります。そのため、姉妹遺伝子による補完作用により、マウスノックアウト研究からではそれらの役割を明らかにすることが困難な場合があります。

このモデルはゼブラフィッシュの胚発生に関する洞察を提供しますが、同様の遺伝的プログラムは通常、進化を通じて高度に保存されているため、その結果はマウスなどの他のシステムにも適用可能です。胚に注入を行う前に、マイクロインジェクションプレートを準備します。100 mmペトリ皿の反転させた蓋に、魚槽システムから直接採取した浄水であるシステムウォーターで調製した2% agaroseを約12 mL注ぎます。

2枚の顕微鏡スライドグラスを、蓋の両側に約45度の角度で設置します。アガロースが凝固したら、スライドグラスを蓋からゆっくりと引き離し、注入中に胚を保持するための溝を作成します。モルフォリノストックは、注入前に1 mMの濃度で滅菌済みの脱イオン蒸留水を用いて室温で保存します。モルフォリノストックを65 °Cで5分間インキュベートし、完全に溶解していることを確認してください。

ストック溶液を室温まで冷却します。新たに設計された各モルフォリノは、活性および胚への耐性を実験的に検証する必要があります。マイクロ遠心チューブを用いて、脱イオン蒸留水でストックモルフォリノを1～2回の連続希釈し、1 mM、0.5 mM、0.25 mM、および0.125 mMの作動濃度を調製します。

解剖顕微鏡下で、マイクロマニピュレーターに取り付け、適切に配置した校正済み注入針に、吸引を用いて溶液を前から充填します。最低濃度のmorpho溶液を約1µL、針に充填してください。その後、転送ピペットを使用して、受精後の1細胞期胚をマイクロインジェクションプレートの溝に移動させます。

ピペットを使用してプレートから余分な水を取り除き、胚が溝の底に落ちるようにします。注入プレートを顕微鏡の下に配置し、針を絨毛膜（corion）経由で卵黄へと刺入します。各胚に注入した後、針を抜き、注入プレートを移動させて次の胚にアクセスします。

注入の習得には、ここに示すようにバイタルダイを用いて細胞への注入を可視化することが有用な場合があります。胚を100 millimeterのペトリ皿に戻し、システムウォーターで28.5 degrees Celsiusにて培養します。針に残っているmorpho溶液をすべて排出し、適切な発生段階にある次の胚群に注入するため、次に高い濃度のmorpho溶液を充填します。注入した各morpho濃度における胚の表現型を確認してください。

各モルフォ（morpho）の閾値用量は、明確で信頼性の高い表現型が現れる最低用量です。不正確な閾値を定義するためには、複数回のタイトレーションが必要になる場合があります。これは、2つの異なる遺伝子間の遺伝学的相互作用を調べるためのものです。

目的とする2種類のモルフォリノを、それぞれ閾値濃度で混合して調製します。1回の注入あたりのモルフォリノ総量が20 nanogramsを超えると、胚が耐えられない可能性があることに注意してください。前述と同様の方法で胚に注入します。

実験群と対照群の間で注入量を一定に保ってください。対照群には、解剖顕微鏡下で各morphoのみを注入したセットを含める必要があります。注入直後および一日の中で数回、注入した胚を観察し、トランスファーピペットを使用して死滅した胚または死にかけている胚を除去してください。これらは残りの胚の生存率を損なう可能性があるため、トランスファーピペットを用いて、鎮静状態または安楽死した胚を随時取り除いてください。

観察用に凹面スライドグラスに載せます。撮影を行う際、必要に応じて鋭いピンセットで絨毛膜を除去してください。

3%メチルセルロースの液滴中で胚を固定し、単一のモルフォリノによる表現型の浸透率の高さではなく、モルフォリノの組み合わせに特有の明確な表現型が現れているか胚をスクリーニングします。ここでは、閾値のモルフォリノを注入した野生型胚をいくつか示します。gata5の場合、前駆細胞が正中線で融合できなかったため、心分断（cardio bifida）または二心心と呼ばれる表現型が典型的に現れます。

矢印で示されたGFP陽性の心筋細胞に注目してください。6-morphine（6-モルフォリノ）の表現型には、適切にループしなかった変形した心臓が含まれます。これらの胚においても、GFP陽性の心筋細胞が発達します。

しかし、ここで示すgata fiveとgata sixの両方のモルフォリノを注入した胚では、心筋細胞の発達が完全に消失しており、心筋細胞の発達にはgata fiveまたはgata sixのいずれかが発現している必要があることが示唆されます。これら2つの遺伝子は、心筋細胞の分化決定において機能的に冗長です。

この手順を試みる際は、まず使用するモルフォリノ（morpho）を完全に検証し、本手順に従った結果が単一の標的遺伝子の真のノックダウンを代表していることを可能な限り確実にすることが重要です。同様の遺伝子機能が哺乳類においても存在することを示すために、条件付きマウスヌルアレルを組み合わせるなどの他の方法を実施することができます。

ビデオを視聴することで、胚発生過程において2つの遺伝子が機能的に冗長であるかどうかを判定する方法について、十分に理解できるはずです。