アクリルアミド系ハイドロゲルを用いた細胞機能のマトリックスの剛性の影響を研究

アクリルアミドハイドロゲルを用いて、in vivoの組織コンプライアンスをモデル化します。まず、反応性ボトムカバーガラスとシリコン処理済みトップカバーガラスを作成し、次にアクリルアミドハイドロゲルを注入して作製します。

手順の3番目のステップは、選択した細胞外マトリックス蛋白質をハイドロゲルに架橋させることです。手順の最終ステップは、細胞のインキュベーションと解析です。最終的に、免疫蛍光顕微鏡法、リアルタイム定量PCR、およびウェスタンブロッティングを用いた解析を通じて、in vitroにおける細胞外マトリックスのコンプライアンスの変化がどのように細胞挙動を制御するかを示す結果を得ることができます。

本日は、アクリルアミドハイドロゲルの作製および使用手順について解説します。当研究室では、細胞の形態、細胞シグナル伝達、および増殖を制御する細胞外マトリックスの剛性を研究するために、この手法を用いています。それでは始めていきましょう。

まず、反応性カバーガラスを作成することから本手順を開始します。最初に、150 mmのペトリ皿の下半分にパラフィルムを敷きます。次に、オートクレーブ滅菌済みの25 mmカバーガラスを最大9枚パラフィルム上に移し、0.1 M 水酸化ナトリウム 1 mLで覆います。

カバーガラスを3分間インキュベートします。インキュベーション後、化学フード内で真空ラインを使用して水酸化ナトリウムを吸引除去します。各カバーガラスに0.5 millilitersの3-aminopropyltrimethoxysilane（3-APTMS）をピペッティングします。カバーガラスを3分間インキュベートし、その後3-APTMSを吸引除去します。カバー上に泡が発生するのを防ぐため、インキュベーション時間が長くなりすぎないよう注意してください。

処理後のカバーガラス。同じディッシュ内で、カバーガラスを脱イオン水 20 milliliters で1回すすぎます。曲がったピンセットを用いてカバーガラスをディッシュから取り出し、処理面を上にして新しい 150 millimeter ディッシュに移します。

次に、カバーガラスを再度脱イオン水で洗浄し、ロッカーの上に置いて10分間放置します。インキュベーション後、水を除去し、さらに2回洗浄します。グルタラルデヒドを使用する10分前までに、すべてのA-P-T-M-Sを除去することが非常に重要です。さもないと、グルタラルデヒドと反応して白濁した沈殿が生じます。

曲げ鉗子を用いて、カバースリップをparamを敷いた清潔なディッシュに移し、真空ラインを用いて残液を吸引します。次に、各カバースリップを0.5 mLの0.5%グルタルアルデヒド（滅菌脱イオン水溶液）で完全に覆い、3つのA-P-T-M-Sとポリアクリルアミドゲルを架橋させます。化学薬品用フード内でカバースリップを30分間インキュベートします。その後、グルタルアルデヒドを吸引し、カバースリップを脱イオン水で再度洗浄します。

その後、カバーガラスを完全に乾燥させます。クロロホルムで調製した10%表面封止溶液を含む50 milliliterのFalconチューブに新しいカバーガラスを加え、少なくとも10分間揺動させます。表面封止溶液を捨て、風乾させます。

ハイドロゲルの作製を開始するため、生物学的安全キャビネット内で、キムワイプの上にカバーガラスを置きます。湾曲ピンセットを使用して、カバーガラスの反応面を上に向け、生物学的安全キャビネットの表面にテープで固定したパラフィルムの上に移動させます。カバーガラスがパラフィルムの表面に平らに置かれていることを確認してください。

次に、少量のNHSを十分な量のトルエンに溶解させて、飽和したヒドロキシCIN aideまたはNHSトルエン溶液を調製します。具体的な実験では、NHSが溶けなくなるまで少量のNHSを添加してください。飽和溶液は通常、白濁したピンク色になります。

次に、目的のアクリルアミド濃度にするために、アクリルアミド、BISアクリルアミド、水、およびPSを調製します。記載のプロトコルに従い、試薬をマイクロチューブに加えます。その後、1アリコートずつ加えてください。

NHSとTMを添加します。チューブを短時間ボルテックスし、直ちにバイオセーフティーキャビネット内で、カバーガラス1枚あたり140 µLずつ、3〜5枚のゲルに分注します。重合が始まる前に、シリコン処理された25 mmカバーガラスを各ゲルの上に速やかに配置します。

上部のカバーガラスを載せることで、アクリルアミドが下部のカバーガラス全体を覆うようになります。このサンドイッチ構造を室温でインキュベートし、アクリルアミドが重合するまで待ち、重合が完了したかを確認します。マイクロ遠心チューブ内の残留アクリルアミド溶液を確認してください。

重合には、硬いゲルでは数分、柔らかいゲルではそれよりも少し長い時間がかかります。重合が完了したら、滅菌手袋を着用してサンドイッチを慎重に持ち上げてください。次に、上のカバーガラスを、重合したゲルの端に張り出すまでずらします。

次にカバーをこじ開けます。ゲルを取り出し、上側のカバーガラスを廃棄します。以降、ハイドロゲルと呼ぶ底面側のゲルカバーガラスを、6ウェルプレートに配置します。

次に、6ウェルプレートの1ウェルあたり2 mLのリン酸緩衝生理食塩水（PBS）を加えます。その後、ハイドロゲルをPBSで洗浄し、ロッカースイング上で5分間インキュベートします。この洗浄工程を2回繰り返します。

実験を開始するために、各ハイドロゲルに2 mLのフィブロネクチン溶液またはその他の細胞外マトリックスタンパク質を加えて覆います。タンパク質を4 °Cで一晩インキュベートし、ハイドロゲルに共有結合させます。一晩のインキュベート後、ECM溶液を吸引して除去します。次に、1 mg/mLの熱活性化脱脂牛血清アルブミンを含む無血清培地を用いて未反応のNHSをブロッキングし、37 °Cで少なくとも30分間インキュベートします。

インキュベーション後、ハイドロゲルを滅菌PBSで1回洗浄します。次に、胎児牛血清を含む適切な培養液を用いて、ここに細胞をハイドロゲル上に播種します。

確立されたマウス胚性線維芽細胞を使用します。細胞の伸展度合いおよび実験に必要なコンフルエンスに基づき、ハイドロゲルに播種する細胞数を決定します。ウェスタンブロッティングおよび定量PCR分析には、約10⁵個の細胞が必要です。

その後、特定の細胞タイプに応じた適切な条件下で細胞をインキュベートします。インキュベーション期間の後、必要に応じて細胞タンパク質またはmRNAを抽出します。

ラボベンチ上のパラフィルムの上に、溶解バッファーを100 µLずつ滴下し、各液滴の間隔を約2～3 cmあけます。次に、ウェルから底面のカバーガラスを持ち上げ、ハイドロゲルを慎重に回収します。湾曲ピンセットを使用し、細胞側を下にして液滴の上に置きます。

細胞を溶解バッファーとともに正確に1分間インキュベートします。最後に、カバースリップを取り除き、溶解バッファーをマイクロ遠心チューブに移します。あるいは、RNAを抽出する場合は、各ハイドロゲルを新しい6ウェルプレートに移し、1ウェルあたり1 mLのtriazoleを加えます。

インキュベーション後、ゲルを3分間インキュベートします。トリアゾール溶液を回収し、マイクロ遠心チューブに入れて保存します。APTMS添加後、カバーガラスを十分に洗浄することは、反応性カバーガラスを作製する上で重要な工程です。

適切に洗浄し乾燥させたカバーガラスには、沈殿物が残っていない状態でなければなりません。A-P-T-M-Sがグルタルアルデヒドと反応すると、白い濁った沈殿が生じます。沈殿が生じた場合、そのカバーガラスは使用できなくなるため、全手順を繰り返す必要があります。

ハイドロゲルの形成とECMタンパク質によるコーティングの後、細胞を播種し一晩培養します。染色で確認できるように、硬いハイドロゲル上と柔らかいハイドロゲル上で細胞の展展状態には明確な差があり、マウス胚性線維芽細胞は柔らかいハイドロゲルと比較して硬いハイドロゲル上でより広範囲に展展します。実際、柔らかいハイドロゲルに接着したほとんどの細胞は凝縮したままであり、接着効率も低くなります。

マウス胚性線維芽細胞におけるcycling D1 mRNAレベルの代表的な定量的PCR結果は、stiff matrixではcycling D1が有意にアップレギュレートされるが、soft matrixではそうではないことを示しています。これは、マトリックスの剛性がin vitroでの細胞周期進行を調節していることを示唆しています。以上で、in vivoの生理的条件をモデル化した、異なる剛性を持つハイドロゲルの作製方法について説明しました。この手順を行う際は、不慮の事故やエラーが発生することを想定し、予備の反応性カバーガラスを多めに作製しておくことが重要です。

以上となります。ご視聴ありがとうございました。皆さんの実験がうまくいくことを願っております。