表現、界面活性剤可溶化、および膜トランスポーター、MexBの多剤耐性タンパク質の精製

Mex B膜タンパク質を精製するために、まず組換えDNA法を用いてe coliでMex Bを発現させます。次に、膜を単離し、温和な界面活性剤で膜タンパク質を可溶化します。可溶化した膜タンパク質をiMacで精製し、さらにゲルろ過クロマトグラフィーを用いてタンパク質を精製します。

タンパク質の精製度は、SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いて決定します。この手順は多剤耐性膜貫通輸送体に関する知見を得るために有効ですが、他の膜タンパク質にも適用可能です。本日の手順は、私の研究室の大学院生によって行われます。本手順では、Pseudomonas aeruginosa由来のMex BをPET 30B+発現ベクターにサブクローニングし、MexBのC末端にHis-tagが付加された状態で発現させます。夕方に、新鮮な形質転換体または凍結ストックを用いて、3 mLのLB-カナマイシン培地4本に接種します。これらの培養物を、37 °Cのローラー上で一晩培養し、翌朝に回収します。

オーバーナイト培養液を用いて、30 µg/mLのカナマイシンを含む150 mLのLB培地を接種し、37 °Cの振盪機で午後まで培養します。この小規模培養液を用いて、30 µg/mLのカナマイシンを含む1 LのXYT培地6本に接種します。

マイシンをシダバックフラスコに加えます。1:40希釈のため、1培養あたり25 millilitersを使用します。光学密度に達するまで、37 °Cで培養します。

OD$_{600}$が0.4から0.6に達するまで、約1.5時間培養します。培養液が適切な密度に達したら、1 M IPTGを0.5 mL添加してタンパク質発現を誘導します。すべてのフラスコをシェーカーに戻し、翌朝に細菌を回収するまで、30 °Cで一晩培養を継続します。

シェーカーから培養液を回収し、冷却します。次に、細胞を回収するため、培養液を遠心チューブに移し、大型遠心機を用いて4 °Cで5,000 rpmで30分間遠心分離します。細胞の遠心分離を行っている間に、100 mLの細胞再懸濁緩衝液にDNAse、プロテアーゼ阻害剤、およびリゾライムを添加します。

また、この表に示されているように、メンブレン再懸濁緩衝液の2つの分注分にプロテアーゼ阻害剤を添加します。遠心分離が完了したら、3つの溶液すべてを氷上で保持してください。細胞ペレットを100 millilitersの細胞再懸濁緩衝液で再懸濁します。

次に、細胞を破砕します。細胞懸濁液をフレンチプレスセルに充填し、セルをフレンチプレスにセットします。圧力を12,000 pounds per square inchに達するまでかけます。

破砕された細胞が少しずつ流れ出るように、バルブをごくわずかに開きます。バルブを開けすぎると細胞が勢いよく噴き出しますが、それでは圧力が不十分な状態で放出されるため、効率的に破砕されません。細胞溶解物は、氷上で冷却したボトルに回収してください。

細胞懸濁液を、再び12,000 pounds per square inchのフレンチプレスに通します。細胞溶解液をSS 34遠心管に移し、SS 34ローターを用いて4 °Cで10,000 rpmで30分間遠心分離し、細胞残渣を除去します。これにより、清澄化された溶解液が得られます。

膜画分を調製するために使用します。上清をTI 6 4, 7 0.5超遠心管に慎重に移し、TI 6 4 7 0.5ローターを用いて40,000 rpmで50分間、4 °Cで遠心分離します。

上清を廃棄します。ピペットを使用して、細胞膜を含むペレットを約25 millilitersのmembrane Resus suspension bufferで穏やかに再懸濁します。膜懸濁液を清潔な遠心管に移し、TI I 6 4 7 0.5ローターを用いて40,000 rotations per minuteで50 minutes、4 degrees Celsiusで再度遠心分離し、洗浄した膜ペレットを25 millilitersのmembrane Resus suspension bufferで再懸濁します。次に、再懸濁した膜に対し、約25 millilitersで膜タンパク質を可溶化します。

最終的な界面活性剤濃度が2%DDMとなるように、10%DDMを6mL加えます。混合物を4°Cで2時間揺盪させます。DDM存在下で2時間のインキュベーション後、TI I 6 4 7 0.5ローターを用いて、混合物を40,000rpmで40分間、4°Cで遠心分離します。これにより、可溶性タンパク質-界面活性剤複合体と不溶性タンパク質を分離します。MexBタンパク質-界面活性剤複合体を含む上清を回収し、精製に使用します。MexBタンパク質-界面活性剤複合体を含む上清を、Resus懸濁緩衝液で平衡化した2mLの金属アフィニティービーズと混合します。ローラーを用いて4°Cで1時間インキュベートし、タンパク質をレジンに結合させます。

スラリーを重力フローカラムボディに注ぎ、通り抜けた液を廃棄します。カラムの洗浄が完了したら、20 mLまたは10カラムボリュームのiMac結合・洗浄バッファーでカラムを洗浄します。結合したタンパク質を10 mLのiMac溶出バッファーで溶出させます。

各溶出分画から10 µLのサンプルを採取します。2倍濃度のSDSサンプルバッファー10 µLと混合し、10%ポリアクリルアミドSDSゲルで分析します。

各フラクションに含まれるMex Bの量と純度を推定します。Mex Bタンパク質界面活性剤複合体を含むフラクションを回収し、4 °Cでスピン濃縮器を用いて濃縮します。このステップでタンパク質が沈殿しないよう注意してください。

数回の短時間遠心分離を行い、沈殿が生じないか確認します。その後、回収した分画を合わせて、ゲルろ過カラムを用いて精製します。Superose 12 HL 30 10/300 GL カラムを 24 milliliters のランニングバッファーで予備平衡化し、ベースラインが安定するまで待ちます。

次に、アクターシステムのローディングループをランニングバッファーで洗浄します。タンパク質をカラムに適用する前に、シリンジフィルターを用いてタンパク質溶液をろ過してください。その後、最大5 mg/mLの濃度のタンパク質溶液を、最大240 µLまでカラムにロードします。

1.5カラムボリュームのバッファーを流し、0.25 mLずつ分画して回収します。XBタンパク質界面活性剤複合体は、溶出量約10〜15 mLでピークとして溶出します。ピーク分画から5 µLのサンプルを採取します。

各サンプルを2倍濃度のSDSサンプルバッファーと1対1の比率で混合します。10%ポリアクリルアミドゲルでサンプルを分析し、各画分中のMex Bの量と純度を推定し、純粋なMex Bを含む画分を回収します。このポリアクリルアミドゲルには、iMacカラムから回収した画分およびゲルろ過カラムからの個々の画分をロードしました。ゲルろ過カラム後のタンパク質は、クマシー染色したポリアクリルアミドゲル上で純粋な状態で現れます。

ゲルろ過カラムのトレースは、タンパク質-界面活性剤複合体のメインピークがカラムから溶出していることを示しています。mxbタンパク質の平均収量は、2 XYT培地6Lあたり約2mgです。習熟すれば、適切に実施することでこの手順を8時間で完了させることができます。このビデオを視聴することで、膜タンパク質の発現、可溶化、および精製方法について十分に理解できるはずです。