に対する事前定義されたT細胞受容体の特異性をもつTransnuclearマウストキソプラズマ SCNTを介して取得

抗原特異的T細胞受容体を持つトランスジェニックマウスは、体細胞核移植（SCNT）を用いてあらかじめ定義されたT細胞受容体特異性を持つマウスモデルを作出することができ、T細胞の発達と機能の研究において不可欠となっています。マウスに目的の病原体を感染させ、そのマウスからT細胞を単離し、フローサイトメトリー（FACS）によって精製します。

精製したT細胞を、その後、体細胞核移植に使用します。胚が胚盤胞期に達した後、胚性幹細胞を単離します。これらの細胞を胚盤胞に注入し、それを擬妊娠マウスに移植します。

得られたパピーでは、目的のT細胞集団が著しく増加しており、これはPAX解析によって検証可能です。こんにちは、私はWhite Institute for Biomedical Researchのポストドク、Okta AKです。本日は、体細胞CLE転移ブラストアシスト注入および胚移植の実施方法について説明します。

体細胞移植の主な利点は、内在性遺伝子座からT細胞受容体を発現し、したがって内在性プロモーターの制御下にあるマウスモデルを非常に迅速に作製できることです。体細胞液体移植は、あらかじめ定義されたT細胞受容体またはB細胞受容体の特異性を持つマウスモデルを作製するためのツールとして利用できます。これは、自己免疫疾患、感染症、癌などの分野に従事する研究者にとって特に有用です。

Toxoplasma gondiiなどの病原体に特異的なT細胞を分離するため、免疫応答のピーク時に腹腔内注射で感染させたマウスを安楽死させ、脾臓を摘出します。その後、ドナー細胞をホモジナイズして分離し、蛍光標識抗体および適切なテトラマーとともにインキュベートします。最終的に、 FACSソートを行い、病原体特異的なT細胞を取得します。卵母細胞の脱核操作の前夜に。

注射器を用いて水銀を後方充填し、4 µm、5 µm、および 7 µm のピソ注入針を準備します。翌日、卵母細胞を回収して体細胞核移植プロトコルを開始し、マウスピペットを使用して、シャーレ内の K-S-O-M-A-A Medium の液滴に卵母細胞を移します。シャーレの蓋の中で。

PVPを約10滴、5 µg/mLのcyto Bを含むHCZBを約10滴、および2.5 µg/mLのcyto Bを含むHCCBを約10滴滴下し、体細胞核移植（SCNT）用のプレートを準備します。このプレートをSCNT-Aプレートと呼びます。SCNT-Aプレートを倒立複合顕微鏡のステージ上に設置します。

次に、7 µmの核除去用ニードルをマイクロマニピュレーターに装着し、廃棄用PVP溶液を5〜10回吸引して洗浄します。続いて、ペトリ皿から10〜30個の中期第2停止卵母細胞を、5 µg/mLのCyto Bを含むHCCBの液滴の一つへと移します。SCNTプレート上で室温で5分間インキュベートし、その間に卵母細胞を水平に並べます。

5分経過後、摘出用針を用いて、保持用針の前に卵母細胞を配置します。マイクロインジェクターを使用し、吸引圧をかけて卵母細胞を保持用マイクロピペットに固定します。

次に、核抜去針を用いて、透明帯よりも非常に透明に見える染色体紡錘体複合体が3時の位置に来るまで卵細胞を回転させ、ペダルを押してピエゾパルスを発生させ、透明帯を貫通させます。ピエゾパルスとは、縦方向に伝わり核抜去針の先端を振動させる機械的パルスのことです。この先端の振動により、透明帯への穿孔が容易になります。

zona pellucidaを通過させた後、核抽出用ニードルの開口部を中期第2紡錘体に近づけ、真空を適用します。染色体紡錘体複合体がゆっくりとニードル内に移動します。ニードルを抜去すると、膜は自然に封鎖されます。

最後に、口ピペットを使用して、脱核した細胞をK-S-O-M-A-A滴に戻します。次に、同じピペットを用いて、KSOM AAの滴から滴へと移し替えて洗浄します。核移植を行うには、マイクロマニピュレーターの7 µm脱核用ニードルを、4〜5 µmの核移植用ニードルに交換します。前述と同様に、PVPでニードルを洗浄してください。

あらかじめ単離しておいたCD eight陽性T細胞を、S-C-N-D-Aプレート上のPVPの一滴に滴下します。よく混ぜ合わせ、室温で少なくとも10分間インキュベートします。次に、10から30個のENUCLEATED cytesを、2.5 micrograms per milliliterのHCZBの一滴に移します。

S ct. Aプレート上のCyto Bを室温で5分間インキュベートします。インキュベーションの間、核移植用ニードルを用いて、注入用ニードルで細胞を水平に整列させます。

PVP培地からドナーのCD8陽性細胞をピックアップし、外膜が崩壊するまで吸引と排出を繰り返します。必要に応じてピエゾパルスを加え、膜の断片と細胞質が見えるようにします。その後、核を針の中に吸い上げます。

その後、核が10個から30個になるまで回収を続けます。次に、脱核された卵子が整列している液滴に移動します。吸引をかけて、1つの卵子を保持針に固定します。

次に、核を opening とは反対方向に向けた状態で、NU核移植針を zop lucita の隣に配置します。針が zop lucita を貫通するまで、pizo パルスを印加してください。マイクロマニピュレーターを操作し、慎重に1つの核を針の先端まで移動させます。

針の先端が3分の2ほど入るまで、卵母細胞に針を刺します。わずかに陰圧をかけ、卵母細胞膜が少しだけ針の中に入るようにします。次のステップは非常に重要です。

卵母細胞が実際に開いている唯一のタイミングであるため、ZOパルスを1回照射します。その後、陽圧をかけて核をニードルから押し出します。

針を慎重に引き戻し、先端が卵細胞の約3分の1まで入った状態にします。その後、陰圧をかけながらさらに針を引き戻して、卵細胞を封鎖します。各卵細胞に対してこの手順を繰り返します。

すべての卵母細胞に核が導入された後、それらをペトリ皿に移し、37 °Cで少なくとも30分間インキュベートしたKS OM AA培地のドロップ間を順次移動させて洗浄します。インキュベーション後、SCNT胚を塩化ストロンチウムを含むカルシウムフリー活性化培地のドロップに移します。塩化ストロンチウムは、受精時に同様に起こるカルシウム振動を誘導することで、卵母細胞を活性化させます。

6時間インキュベートします。必要に応じて、ヒストン脱アセチル化酵素の非特異的阻害剤であるTSAを活性化培地に添加してください。活性化後の効率を向上させるため、倒立顕微鏡で胚を観察し、偽前核（pseudo pronuclei）の数またはPPN陽性のSCNT胚を判定します。PPNは、その外見に基づいて識別可能です。

それらは卵のように見えます。サニーサイドアップ法で洗浄し、培養します。胚をK-S-O-M-A-A液中で37 °Cにて3日半、胚盤胞期に達するまで培養します。

まずは、先ほど示した核形成および核移植の手順を正確に実施することに重点を置いてください。これらの技術を習得すれば、以降の手順はより容易に管理できるようになります。ここで使用した胚性幹細胞（ES細胞）は、標準的な手法を用いて誘導されたものです。

これらは、交配から3日半後、胚盤胞アシスト注射を行う当日に準備してください。滅菌済みバクテリアディッシュの蓋に、PVPとHCZPを含む液滴を滴下して準備します。次に、以前と同様に、pisoパルス用の15 µm注射針を準備します。

次に、注入用針をマイクロマニピュレーターに装着し、PVP転送を用いて洗浄します。HCZB滴の中で10～30回のブラストアシストを行います。その後、5～50 µLのESL懸濁液を別のHCZB滴に滴下します。

ES細胞は、容易に回収できる十分な量である必要がありますが、密集しすぎてはいけません。次に、注入用針を用いて30から100個のES細胞を回収します。その後、ブラストアシストのある液滴まで移動させます。

ブラストアシストを水平に合わせ、ホールディングニードルで吸引して固定します。インジェクションニードルを用いてブラストアシストを回転させ、内細胞塊が9時の位置にくるようにします。インジェクションニードルを3時の位置に配置します。

針先にES細胞が付着していないことを確認し、注入針が透明帯（zona pellucida）と栄養外胚葉（tropectoderm）を貫通して胚盤胞（blastocyst）内部に到達するまで、ピソパルス（piso pulse）を適用します。5〜15個のES細胞を放出し、内細胞塊（inner cell mass）に付着させます。すべての胚盤胞への注入が完了するまでこの操作を繰り返します。

K-S-O-M-A-Aで2回洗浄し、擬妊娠マウスへの外科的胚移植を行う。麻酔をかけた擬妊娠レシピエントマウスを術野に配置する。電動シェーバーを用いて、右下腹部の被毛を除去する。解剖顕微鏡下で、ヨウ素溶液および70%ethanolを用いて当該部位を消毒する。

ハサミで皮膚を切開し、次に閉じた状態のハサミを皮膚と腹膜の間に挿入して開き、腹膜を皮膚から分離させます。腹膜越しに、赤い点として見える卵巣を探します。その後、その領域の腹膜をハサミで切開します。

ピンセットを用いてUCTまたはその周囲の脂肪を慎重に掴み、マウスピペットに接続したキャピラリーを使用して子宮を取り出します。ピンセットで卵管と子宮を保持しながら、約10個の胚盤胞のグループを回収します。針を用いて子宮に小さな穴を開けます。

次に、ブラストアシスト（胚盤胞注入用キャピラリー）を装着したキャピラリーを子宮腔内に挿入し、放します。子宮を腹腔内に戻します。腹膜の端を確認し、数針で縫合して閉じます。

マウスの皮膚を数箇所のステープルで閉鎖します。鎮痛剤を皮下に投与します。その後、マウスを加熱ランプのあるケージに戻します。

マウスが覚醒するまで呼吸をモニタリングします。脱核および体細胞核移植を行った結果、胚の約 70% で擬似前核が確認されました。

この図に示すように、TSAによる6時間または10時間の処理では効果が見られませんでした。培養から3日半後、胚の5〜10%が胚盤胞へと発育しました。

同様に、TSAの添加は胚盤胞アシストの発達率に影響を与えませんでした。その後、SCNT胚盤胞アシストを用いて胚性幹細胞を誘導しました。TSAの添加により、胚盤胞アシストからESLが誘導される効率が有意に向上しました。

S-C-N-T-E-S細胞を用いてキメラマウスを作製します。これらのマウスから血液を採取し、ここに示すようにフローサイトメトリー分析を用いて特定のT細胞の存在を解析します。血液を抗CD4抗体および特異的テトラマーで染色すると、ダブルポジティブの集団を同定できます。

これにより、SCNTに使用したドナー細胞が正しい特異性を持っていたことが示されました。ここまで、体細胞のLU転移、胚盤胞補助注入、および胚移植の方法について説明しました。最も重要な考慮事項は、T細胞またはB細胞の純度です。

体細胞移植の方法を習得し、胚が胚盤胞期に達した後は、それらを擬妊娠雌に直接移植するか、あるいは胚性幹細胞の樹立およびキメラマウスの作製に使用するかを選択できます。