電離放射線は、次のγH2AXの空間分布の評価

こんにちは。私はBaker IDI Heart and Diabetes Instituteで博士課程に在籍しているRaja Tiです。今回は、心筋細胞におけるDNA損傷とクロマチン凝縮を示すエピジェネティックな修飾の3Dイラストレーションに関する手順について解説します。DNAは核内領域に巻き付いています。

各ヌクレオソームは、H2A、H2B、H3、H4の4種類の異なるヒストンで構成されています。DNA断片化が起こると、H2AXのリン酸化によってそれが標識されます。このH2AXのリン酸化は、主にH3K4のメチル化によって標識されたクロマチン領域で起こります。それでは、リン酸化H2AXとメチル化H3K4で免疫標識された細胞内の修飾に関する3Dイラストレーションを確認しましょう。

それでは始めましょう。まず、細胞懸濁液を15 mLのFalconチューブに入れます。1,500 Gで遠心分離して2回洗浄し、再懸濁します。

放射線が細胞事象に及ぼす即時的な影響を確認するため、新鮮な培地で懸濁させます。放射線照射前および照射中の5〜10分間、細胞を眼上に保持します。細胞にガンマ線またはX線を照射します。照射後、細胞懸濁液3 mLを6つのGUのそれぞれに分注します。

ピークγ-H2AX測定用のウェルプレートを用い、細胞を37°Cで30分から1時間インキュベートします。非接着細胞をガラススライド上に配置するために、サイトスピン遠心機を使用します。サイトスピンクリップを組み立てる際は、フィルターカード全体が漏斗と一致していることを確認してください。

細胞懸濁液を50 µLずつ分注し、各サイトシンクリップに塗布します。サイトシンクリップをサイトシンミッションにセットし、500 RPMで5分間遠心分離します。サイトシンクリップを取り出し、フィルターカードからスライドを分離します。フルオレセイン染色の背景に影響を及ぼす可能性があるため、細胞を長時間空気乾燥させないでください。

液体ブロッキングピンを用いて各スメアの周囲に円を描き、室温で5分間、4%パラホルムアルデヒドで細胞を固定します。エタノールやオイルと比較して、4%パラホルムアルデヒドでより良好な固定が観察されました。PPSスライドガラスを用い、室温で5分間、Triton X 100で細胞を透過処理します。

Triton X 100を用いた場合、twin 80と比較して細胞内のより良好なシグナルが観察されました。PP S3で細胞を5分間ずつ3回観察してください。他のブロッキング剤や処理時間と比較して、1% BSAを用いて室温で10分間のブロッキングを3回繰り返してください。

一次抗体の非特異的結合を最小限に抑えるにはBSAが最も効率的でした。本手法では、1%BSAを含む溶液で500倍に希釈した2種類の一次抗体を使用し、各スライドに約50 µLずつ滴下しました。一次抗体を室温で60分間インキュベートすることで、4 °Cで一晩インキュベートする場合よりもバックグラウンド染色を低減できます。その後、PBSで5分間の洗浄を3回行います。

Alexa Fluor 488 抗マウス抗体および Alexa Fluor 546 抗ウサギ抗体を使用した。異なるマーカーを同時に染め分けるために二次抗体を用いた。異なる動物種で作製された抗体を使用すること。

希釈した二次抗体を各スライドに約50 µLずつ加えます。室温で90分間インキュベートします。細胞および抗体の乾燥を防ぐため、湿室内でインキュベートすることをお勧めします。PBSでスライドを5分間ずつ3回洗浄します。

PBSで500倍に希釈したtopo threeを、各スライドに50 µLずつ添加した。PBSで各5分間、3回スライドを洗浄した。スライドから余分な水分を除去し、Antifa溶液を添加した。

Antifa溶液を添加する前に、細胞を完全に乾燥させないことが推奨されます。スライドグラスの上にカバーガラスを載せます。気泡が形成されないように注意してください。

スライドを暗い湿潤チャンバーに入れ、一晩放置します。細胞の乾燥を防ぐため、ネイルポリッシュでスライドを封止します。共焦点顕微鏡で取得した画像により、以下のことが明らかになります。

より高い空間分解能を得るため、画像取得にはヘリウムネオンレーザーを使用した。対物レンズは、より高倍率または低倍率のレンズよりも、63倍の油浸対物レンズが好ましい。3倍または4倍のズーム倍率を用いることで、より高分解能な画像が得られる。

多数の細胞からFO定量を行う場合は、スキャン速度を8、画像サイズを1024×1024ピクセルに設定することが望ましい。マルチチャンネルでイメージングを行う際は、フレームスキャンよりもシーケンシャルラインスキャンによる取得が推奨される。試料の退色を防ぐため、検出器ゲインとアンプリファイアオフセットを調整し、ノイズと信号飽和を低減させる。

Kama HX X fourのサイズが0.5 µmを下回る可能性があるため、少なくとも0.5 µmの解像度で画像を取得することが推奨されます。マーク初回およびマーク消失パターンを用いたジェットシリーズパターンの場合、ジェット軸に沿ったステップサイズの画像が必要です。異なるタンパク質間の空間的関係を例示するには、metamor初回を用いて、スキャン速度6、画像サイズ2048 × 2048 pixelsで撮影することが推奨されます。

次に、さまざまな共焦点顕微鏡で取得した画像からカウントを行うことができます。ファイルメニューから直接、またはビル番号を使用してgamma hgx画像タグを開きます。プロセスメニューに移動し、Stack arithmaticを選択してください。

最大投影法（maximum projection）を選択し、含める平面を選択して「OK」をクリックします。次に、トップハット（top hat）を選択し、ソース画像としてGamma H two X画像を選択して適用します。

トップハットフィルタを適用し、得られた画像はノイズが少なく、焦点強度のばらつきが軽減されたバイナリ画像になります。「regions」に移動して領域描画ツールを選択し、核の周囲に領域を描画します。「process」メニューに移動し、「threshold image」を選択します。

包含しきい値を選択し、下限値と上限値を設定します。通常、これら4つの数値に影響を与えるのはしきい値です。最適なしきい値とは、背景の包含を最小限に抑え、forayの包含を最大化する値のことです。

これは、異なる閾値を用いてフォレー数をカウントすることで最適に達成できます。その後、フォレー数を肉眼によるカウントと比較します。DPI画像を選択し、「regions」メニューから「transfer regions」オプションを選択してください。

これで、カウントに使用する対応するforay画像と核画像が準備できました。核領域のほとんどがトップハット変換されています。「Measure」メニューに移動し、「integrated ary analysis」または「IMA」を選択します。「Measure all regions」を選択し、「measure」をクリックしてFTE数を取得します。

これで、各領域のFTE値を「Log data」オプションを使用してスプレッドシートにエクスポートできます。先に作成した各チャネルのジェットプロジェクター画像を開きます。「display」に移動し、「color align」を選択してください。

3つの全チャンネルの統合画像を作成するために、各チャンネルの対応するソース画像を選択します。核内における異なるマーカーの空間的配置を明らかにするため、ラインスキャン解析を行います。計測ツールバーのコマンドに移動し、ラインスキャン解析を選択して、細胞を横切るようにラインを引きます。

これにより、ラインに沿った各チャネルの蛍光強度を示すグラフが作成され、異なるマーカー間の相対的な距離が表されます。スタックから3D画像を作成するには、スタックメニューに移動し、「3D reconstruction」を選択します。3D reconstructionのタイプとして「maximum」を選択してください。

回転平面を選択し、ジェット校正距離を選択します。通常、ユーザーがOKをクリックして3D再構成を作成します。これで、免疫蛍光染色および画像解析のプロトコルは終了です。

要約すると、免疫蛍光共焦点顕微鏡は、細胞核における異なるCマーカーおよびγH2AXフォーカスを三次元的に可視化するための2つの手法です。ご視聴ありがとうございました。