セプターのセルカウンターを用いて細胞培養中の細胞数の決定

Scepter細胞カウンターは、細胞数のカウント、細胞径および体積のモニタリング、ならびに細胞集団の健康状態と品質の確認を行うためのハンドヘルド自動デバイスです。この装置は、精度の向上、操作の簡便さ、低コストでの細胞カウントなど、他の計数法に対して大きな利点があります。Scepterを使用し、グラフィカルディスプレイの指示に従って、使い捨てセンサーに細胞を吸引してください。

その後、細胞をカウントし、装置が細胞濃度と統計結果を報告します。これらのデータはコンピュータにアップロードして解析することが可能です。こんにちは、Millportの研究員のSonyaです。今日はScepterの使い方について説明します。

細胞計数装置 細胞の計数は、in vitro 細胞培養において必要不可欠ですが、手間のかかる工程です。一定の細胞濃度を維持することは、実験の再現性と正確性を確保するために不可欠です。迅速さと正確さが求められる一方で、細胞数などの計数は、細胞の健康状態や増殖速度のモニタリング、不死化細胞や形質転換細胞の評価、後続の実験に向けた播種細胞数の決定、トランスフェクションや感染、そして細胞ベースのアッセイの準備において重要です。

細胞計数において、調査対象となった400人の研究者の71%がヘモサイトメーターを用いて細胞を計数しています。ヘモサイトメトリーは安価である一方、手間がかかり、ユーザーのバイアスや誤用が生じやすく、その結果、不正確な計数につながります。ヘモサイトメトリーにおける誤差の原因としては、サンプル内の細胞分布の不均一さ、サンプル中の細胞数の過多または過少などが挙げられます。

特定の細胞が定義された計数領域内にあるかどうかの主観的な判断。ヘモサイトメーターの汚染、ユーザーによる操作のばらつき、およびヘモサイトメーターへの充填率の変動は、手動計数に伴う退屈な作業を軽減させる要因となります。研究者の29%が自動細胞計数装置を用いて細胞を計数しています。

しかしながら、多くの研究者にとって、これらの大型ベンチトップ装置に伴う価格が導入の障壁となっています。Scepter cell counterは、自動化されたハンドヘルドデバイスであり、使いやすいハンドヘルド形式で、Coulter計数法と同等の自動化と精度を比較的低コストで提供します。このシステムは、インピーダンスに基づいた粒子検出というCoulter原理を採用しており、アナログおよびデジタルハードウェアを組み合わせて小型化することで、センシング信号処理、データ保存、およびグラフィカル表示を実現しています。

この使い捨てセンサーは、マイクロファブリケーション技術による細胞検知ゾーンを備えており、精密な液体ハンドリングチャネルと電子回路によって強化され、サブミクロンおよびサブピコリットルの分解能で細胞サイズと細胞体積による識別が可能です。Scepter細胞カウンターは、細胞集団の統計をヒストグラムとして視覚的に表示します。Scepter細胞カウンターによる測定は、まずリン酸緩衝生理食塩水を用いて細胞の単一細胞懸濁液を希釈することから始めます。

1 mLあたり10,000〜500,000個の細胞濃度が最適です。希釈した細胞液100 µLを1.5 mLマイクロビューチューブに移します。装置背面のトグルスイッチを長押ししてScepter細胞カウンターの電源を入れ、画面に指示が表示されるまで待ちます。

指示に従い、電極センシングパネルを装置の前面に向けて、セプターユニットの先端にセンサーを取り付けます。セプターセンサーは、電子センシングゾーンと統合セルセンシング電極を備えた精密成形のサンプリングチャンバーで構成されています。これらのセンサーにより、サブミクロン分解能での細胞サイズの識別およびサブピコリットル分解能での細胞体積の識別が可能になります。

一貫したセンサーエンジニアリングにより、等しいサンプル量のカウントと正確なサイズ測定が保証されます。センサーを取り付けたら、画面上の指示に従ってカウントプロセスの各ステップを次のように実行してください。画面に「プランジャーを押し下げて開始してください」と表示されたらプランジャーを押し下げます。次に画面に「センサーを浸してください」と表示されるので、センサーを細胞懸濁液に浸し、プランジャーを離して細胞懸濁液をセンサー内に吸引します。

プランジャーは電気信号として機能し、サンプルとデッドボリュームをセンサー内に吸引します。ピペッティングとは異なり、プランジングの速度や精度は重要ではありません。準備が整うと、この工程には数秒かかります。

装置からビープ音が鳴り、画面に「sample loaded」と表示されます。サンプルがセンサーにロードされると、センシングゾーンを通過し、細胞サイズと細胞体積が測定されます。その後、マイクロチャネルを通過し、50 µLのサンプルがカウントされると、センサーが装置にカウント停止の指示を出します。

カウントが完了すると、装置の画面に「count complete」と表示されます。センサーを取り外して廃棄してください。画面の指示に従い、センサーを取り外して廃棄します。

その後、装置の画面に細胞サイズまたは直径のヒストグラムと、1 mLあたりの細胞濃度が表示されます。カウントが完了し、装置にヒストグラムが表示されたら、トグルボタンを押してゲートを適用します。「auto gating」を選択してヒストグラムのプロファイルに基づいてゲートを自動的に設定するか、「use last」を選択して前回のカウントのゲートを使用します。どちらの選択肢を選んだ場合でも、ゲートを手動で移動させて微調整することが可能です。

データを調整し、トグルボタンを再度押して左ゲートを選択し、トグルをスクロールしてゲートを任意の位置に移動させます。次に、もう一度トグルを押して右ゲートを有効にし、トグルをスクロールして右ゲートを配置します。最後に、再度クリックします。

新しい細胞濃度、平均細胞容積および直径が表示されます。トグルスイッチを切り替えることで、表示を日付・時刻、平均細胞サイズ、または平均細胞容積に変更することができ、最大72個のヒストグラムを装置本体に保存可能です。データを個人用コンピュータにアップロードするには、USBケーブルポートで装置を接続し、PCのディスプレイ画面で操作してください。

scepterソフトウェアアプリケーションをダブルクリックして起動します。次に、「connect」をクリックします。すべてのカウントが自動的にソフトウェアに転送されます。

Scepterアプリケーションソフトウェアは、培養細胞の集団分布を体積または直径で詳細に示したヒストグラムを表示します。ダウンロードしたファイルはMicrosoft Excelにエクスポートでき、そこでは生データが指定された細胞直径または細胞体積のビン（階級）ごとに表示されます。19種類の異なる細胞株を計数用に調製し、細胞カウンターを用いて理論的な開始濃度を決定しました。

これらの細胞懸濁液をさらに希釈し、理論上の細胞濃度の細胞懸濁液を得ました。その後、Scepter細胞カウンターを用いて細胞濃度を測定しました。この図は、5つの代表的な細胞株について測定した5つの希釈系列と、それぞれの理論上の細胞濃度を示しています。

R2値（決定係数）に示される高い線形性は、scepterによるカウントが、テストした細胞株において広い線形動作範囲にわたり信頼性の高い手法であることを証明しています。scepterによるカウントの全体的な相対精度を検証するため、scepterで得られたデータとcoterによるカウント結果を比較しました。scepterによる細胞カウントの対数をcoterによるカウントの対数に対してプロットしたところ、テストしたすべての細胞株においてscepterのカウント値がcoterのカウント値と一致することが示されました。

19種類の細胞株のカウントをZ two coulter counterを用いて行いました。Scepter cell counter、V cellやcount test systemなどの自動画像解析式カウンター、およびhemo TERを用いて、同一の細胞懸濁液および同一の希釈倍数を使用し、製造元の指示に従ってカウントを行いました。本図に示す結果は、Scepterによる計測で得られた細胞濃度が、高い直線性を持ち、理論的な細胞濃度と密接に一致することを示しています。

各細胞株の各希釈段階について、変動係数（CV）のパーセント値を算出した。ここに示した各計数システムについて、動作範囲内における細胞濃度および計数方法に関する19種類の細胞株の平均CV（％）を記載している。Scepter細胞カウンターは、ヘモサイトメーターによる計数よりも精度が高く、標準偏差および平均変動係数がより小さい値を示している。

Scepterによるカウントは、血球計数法よりも10倍速く、他の自動細胞カウンターよりも高速です。ここでは、本ビデオで説明した方法を用いて、SF9、MCF7、およびHC293細胞のカウントを行いました。細胞濃度を測定するのに要した平均時間を記録しました。

血球計数はサンプルあたり1回のみ行われたことに注意してください。Scepterは細胞サイズに基づいて測定を行います。したがって、細胞形態の変化はヒストグラムに反映されます。

健康な培養細胞はきれいなベル型のガウス分布を示しますが、不健康な細胞は死滅し、ヒストグラムを左側にシフトさせます。同様に、50%の死細胞と50%の生細胞の集団を混合した場合にも、ヒストグラムのシフトが観察されました。以上が、研究者の細胞計数方法に革新をもたらしているMillipore社の新しいScepter細胞カウンターの使用方法です。