定量リアルタイムPCR（定量PCR）アレイを用いたプレマイクロRNAとマイクロRNAのプロファイリング

この手順の全体的な目的は、qPCRベースのアレイを迅速かつ確実に自動セットアップすることです。まず、アレイ用のプライマーセットを調製し、スクリーニングするサンプルのマスターミックスを準備します。次に、自動ロボットPCRセットアップまたはマトリックス電子ピペットシステムを使用して、384ウェルプレートの各ウェルにサンプルマスターミックスとプライマーセットを正確に分注します。

準備が完了したら、384ウェルPCR反応をLightCycler 480ベースのPCRプログラムで実行します。手順の最終ステップは、qPCRデータを解析し、それぞれが特定のmRNAを標的とする各プライマーペアについて相対的な発現レベルを決定することです。最終的に、大規模なmRNAセットの発現変化を示す結果を得ることができます。

したがって、特別に開発されたアレイを用いることで、qPCRベースのプロファイリングを通じて、pre-microRNAプロファイル全体、特定のパスウェイ、またはウイルス感染に重要な分子をターゲットにすることが可能です。こんにちは、ノースカロライナ大学チャペルヒル校微生物学・免疫学部から来ましたDirk DMAです。今日は、リアルタイムqPCRのセットアップ方法について、2つの手法を用いて解説します。

一方は手動ピペットを使用し、もう一方はロボットを使用します。私たちはこの技術を用いて、ヒト腫瘍中のpre-microRNAおよび成熟microRNAを測定しています。本日のデモンストレーションは、Pauline ChuとKristen buによって行われます。

それでは始めましょう。この手順を開始するために、-20°Cで保存された、96ウェル形式で0.5 pMの濃度で186組のプライマーペアを含むプライマープレートを用意します。

プレートを室温で解凍した後、ボルテックスして軽く遠心分離します。また、各96ウェルプライマープレートのセットアップのために、CYBER Green 2× PCRミックスを室温で解凍します。4本のマスターミックスチューブが必要です。2 mLのエッペンドルフチューブ4本に、1反応あたり4 µLのCYBER Greenミックス、3 µLのPCRグレード水、および10～20 ngのサンプルDNAまたはcDNAを加えて、マスターミックスを調製します。

各チューブには、ピペッティングによる損失分を考慮し、約100反応分のマスターミックスを入れてください。エピンドルフチューブをボルテックスして混合します。Freedom Tecan EVOロボットを使用して、ロボットの初期化およびEVOwearプログラムのロードを行い、前駆体microRNAアッセイのセットアップを開始します。

次に、ピペッティング精度を妨げる気泡をシステムから除去するため、30 millilitersのシステム液体でロボットを3回フラッシュします。続いて、384ウェルプレートと96ウェルプライマープレートを含むようにロボットプラットフォームをセットアップします。マスターミックス用として、2%bleachを含むトラフ、液体が充填されたシステム容器、および空の廃液容器を用意します。

プログラムの最後で「run」を2回選択し、自動ロボットランを開始します。384ウェルプレートを取り出し、light cycler four 80シーリングフォイルで密封します。その後、プレートを遠心分離します。

密封した384ウェルプレートをホテルのポジション1に素早く配置します。次に、新しいマスターミックスと新しい384ウェルプレートを用いて、プライマープレート2でこの操作を繰り返します。作成した密封済みの384ウェルプレートをホテルのポジション2に配置します。

ホテルからライトサイクラーへロードするための新しいEVO wearプログラムを開き、サイクリングパラメータを設定します。次に、「run」を2回選択します。Freedom Evoが自動的に各プレートをライトサイクラーにロードし、Cyber Green HRMサイクリングプログラムを実行します。

完了後、ロボットを使用する代わりに、書面によるプロトコルに従って結果を確認し、分析します。マトリックス電子マルチチャンネルピペットを使用して、マスターミックスチューブ1の内容物をリザーバーに移します。

電子ピペットを、マスターミックス16 µLを吸引し、8 µLの分注を2回行った後にパージステップを行う設定にします。ピペットの設定後、マスターミックス16 µLを吸引し、384ウェルプレートへの分注を開始します。1列目のA行からO行まで、1行おきに最初の8 µLを分注し、次の列は空けておきます。

2回目の8 µLを、3列目の同じ行に分注します。次に、廃棄容器の上で液を出し切り、1行おき、かつ1列おきのパターンに従ってチップを廃棄します。マスターミックス2をピペッティングするため、プレート全体でさらに5サイクル分注を繰り返します。

マスターミックス1と同じ行を使用しますが、2列目から開始してください。この手順をマスターミックス3および4についても繰り返し、それぞれ1列目と2列目から開始しますが、今回はプライマープレートのB行からP行までを使用します。電子ピペットを2 µLの吸引および分注に設定し、その後にパージステップが続くように設定してください。

96ウェルプライマープレートの1列目A行からH行のプライマーを2 µLずつ、384ウェルプレートの1列目の1行おきに分注し、廃棄容器の上で排出し、チップを廃棄します。1列目と2列目の残りの3種類のマスターミックスについても、このパターンでクアットプライマーの分注を繰り返します。その後、96ウェルプライマープレートの2列目から12列目まで同様の操作を行い、プライマーの各列について384ウェルプレートの2列おきに移動して分注を続けます。

次に、プレートをライトサイクラー用シール、アルミホイルで密封し、遠心分離します。遠心分離後、速やかにプレートをライトサイクラー480にセットし、SYBR Green I HRM検出フォーマットを用いてサイクル処理を行います。

前と同じサイクリング条件を用いて、新しく調製したマスターミックスを使用し、プライマープレート2 Eloquaを用いて新しい384ウェルプレートでこの手順を繰り返します。新規のQPCRベースのアレイを用いたプロファイリングにより、前駆体micro RNAシグネチャーが抽出されます。U6で正規化した平均デルタCT値を算出し、標準化した値をアレイにロードしました。

3つの明確なクラスターを生成したマイナーソフトウェアの結果をヒートマップで表示しています。各プレカーサーmicroRNAの相対的な発現量を示しており、赤色は相対的発現の増加を、青色は減少をそれぞれ表しています。色の強度は発現変化の程度を示しています。

予想通り、大部分の前駆体microRNAは、わずかで見過ごせる程度の変化にとどまりました。しかし、一部の前駆体microRNAは、タイムコース実験を通じて有意に増加しました。さらに、一部の前駆体microRNAの相対的なレベルは劇的に減少しました。

いくつかの例では、それらはヒートマップ解析において同様にクラスターを形成します。実験によっては、ウイルス感染に依存したクラスター、細胞種特異的な前駆体microRNAの発現、あるいは共通の分子やシグナル伝達経路によって制御される前駆体microRNAに依存したクラスターが出現することがあります。

4連複製のKaposi肉腫関連ヘルペスウイルス陰性サンプルから得られた平均サイクルしきい値（Ct値）を示します。重要な点として、高感度のqPCRアレイにより、このサンプル中ではKaposi肉腫関連ヘルペスウイルス潜伏感染関連核抗原（KSHV LANA）は検出されませんでした。しかし、内部コントロールであるU6および高度に発現しているヒト前駆体microRNAであるlet-7aは、どちらも検出可能なレベルで発現していました。

最終的に、予想通り、PCRグレード水を用いた陰性対照ではA-Q-P-C-R産物は得られませんでした。同一のサンプルのデュプリケートを用いて、2種類の異なるプライマーで得られた融解曲線分析の結果を示します。

2つのプライマーペアで融解温度が異なることは明らかですが、各レプリケートにおいてサンプルは正確に同じ温度で融解しています。不適切または汚染の可能性があるサンプルの兆候としては、複数の融解ピークが現れ、2つの異なる入力ソースの存在が示唆される場合などが挙げられます。以上で、ロボットを用いたリアルタイムQPCR実験のセットアップ方法について説明しました。

すべてのコントロールおよび可能な限り多くのハウスキーピング遺伝子を含めることが重要です。それでは、ご視聴ありがとうございました。実験の成功をお祈りしております。