カスタムmicroRNAのマイクロアレイの実験を行う

本手順の全体的な目的は、マイクロRNAマイクロアレイ実験を行うことです。まず、マイクロRNAプローブのライブラリを含むプリント済みマイクロアレイスライドを入手し、適切な品質と量のRNAサンプルを調製します。次に、RNAおよびコントロールDNAサンプルを蛍光色素でラベル化します。

次に、ラベル化された核酸をハイブリダイゼーションのためにマイクロアレイスライドに添加します。最後に、マイクロアレイスライドを洗浄およびスキャンし、スライドを再生します。最終的に、個々のmicroRNAプローブのハイブリダイゼーション強度を解析することで、microRNAのゲノムワイドな発現を示す結果を得ることができます。

この手法は、正常な生理的条件や病理的条件が、グローバルなスケールでマイクロアレイの発現にどのように差をもたらすかなど、遺伝子発現分野における重要な疑問を解決するのに役立ちます。マイクロアレイ作製の品質は、マイクロアレイ実験を成功させるための最も重要な要因の一つです。スモールRNAを保持する手法を用いてRNAを単離し、2 mg/mL以上の濃度で再懸濁させた後、約 25 µgのトータルRNAを、T4 RNA Ligase 1、DTT、ATPを添加した1 X HEPsバッファー中の0.5 µgの5' P-C-U-D-Y 5 4 7 3'と混合し、反応容量20 µLでRNAをラベルします。利用可能なRNA量が少ない場合は、RNA量および反応スケールを縮小してください。

RNAの濃度が非常に低い場合は、沈殿を促進するために酵母tRNAなどのキャリアを添加し、冷蔵庫内の氷上で2〜24時間インキュベートします。次に、酢酸ナトリウムを最終濃度0.3 Mになるように加え、さらに3倍量のエタノールを加えて、-20 °Cで一晩RNAを沈殿させます。スライドを初めて使用する場合は、3 X SSC、0.1% SDS、および0.2% BSAを含むろ過済みの溶液中で、37 °Cで30〜60分間プレハイブリダイゼーションを行います。

次に、スライドを数回水に浸します。その後、イソプロパノールに浸し、スライドアダプターを装着した遠心機を用いて、22 °Cで100 ×gにて5分間乾燥させます。リフターストリップを水で洗浄します。

その後、エタノール中で、マイクロアレイハイブリダイゼーションチャンバーのベースにスライドを置き、リフタースリップをスライドの上に載せて、リフタースリップがプローブ領域とその白いストリップを覆うようにします。暗所でスライドを接触させ、沈殿したラベル付きRNAをスピンダウンし、70%ethanolで1回洗浄した後、ペレットを風乾させます。ペレットは赤色になるはずです。

RNAサンプル1検体あたり、精製済み標識リファレンスDNAを液量の1/100から1/15の割合で配合してハイブリダイゼーション溶液を調製します。ハイブリダイゼーション溶液が乾燥しないように、約60 µLのハイブリダイゼーション溶液を用いてRNAペレットを完全に溶解させます。インキュベーションの間、マイクロアレイハイブリダイゼーションチャンバーベースの各加湿ウェルに20 µLの水を加えます。

ラベル化RNAとリファレンスDNAの混合液をスライドに滴下します。細いピペットチップを用い、リフタースリップの端に軽く触れさせ、吸引によって溶液をリフタースリップとスライドの隙間に導入します。

ハイブリダイゼーションチャンバーのカバーをベースの上に置きます。次に、メタルクリップでチャンバーを密封します。チャンバーカセットに付属のプラスチック袋の中に、チャンバー全体を入れます。

最後に、チャンバーカセットを濡れたペーパータオルを入れた容器に入れます。次に、容器をプラスチックラップで覆い、37 °Cの加湿細胞培養インキュベーター内に約24時間置きます。ハイブリダイゼーション後のスライドを処理するには、チャンバーカセットを一つずつ分解し、スライドとそのリフタースリップを22 °Cの2 XSSCに浸します。

リフタースリップは自然にスライドから脱落します。スライドを0.8 XSSCで2回、次いで0.4 XSSCで3回、計1～2分間洗浄します。スライドアダプターを備えた遠心分離機を用いて、スライドを乾燥させます。次に、マイクロアレイスキャナーでスライドをスキャンし、blue fuseなどのプログラムを用いて画像ファイルの強度を定量します。

個々のスポットを検査し、通常はポアースライドの印刷やハイブリダイゼーション後のスライド操作に起因する異常なスポットを除外します。データ解析および提示には、GeneSpringやExcelなどのプログラムを使用してマイクロアレイを再利用します。スライドを水で洗浄し、その後、62°Cに予熱した1mM NaOHおよび0.1X SSCの染色皿に10〜20分間浸して、スライドをストリップします。

インキュベーションを2回繰り返します。22 °Cで緩やかに振盪しながら、スライドを水で最大60分間、数回洗浄します。遠心機を用いてスライドを乾燥させ、22 °Cで保存します。

スライドは前ハイブリダイゼーションなしで使用可能です。この図は、非常に精密で強力なハイブリダイゼーション信号を示すマイクロアレイのスキャン画像です。赤色のスポットはリファレンスDNAのハイブリダイゼーションによるもので、緑色のスポットはDY 5 47標識RNAサンプルによるものであり、黄色のスポットはDNAとRNAの両方が同一のプローブにハイブリダイズしたことによるものです。

マイクロアレイハイブリダイゼーションのテクニカルリプリケート間におけるピアソン相関係数は約0.99であり、優れた再現性を示しています。このビデオを視聴することで、micronaseの定量だけでなく、mRNAなどの他の種類の核酸を定量するためのカスタムマイクロアレイ実験の実施方法について十分に理解できるはずです。