のUV -誘発複製中間体の可視化 E.大腸菌二次元アガロースゲル分析を用いた

この手順の全般的な目的は、2次元ゲル解析を用いて、複製がDNA損傷に遭遇した際に生じるDNA構造中間体を可視化することである。まず、複製を阻害する損傷を誘導した活発に分裂している細胞からDNAを単離し、次にゲル電気泳動を用いて回収したDNAをサイズに基づいて分離することで、これを達成する。

次に、レーンを切り出し、サイズと形状の両方に基づいてDNAをさらに分離させる2枚目のゲルに水平方向に再キャストします。最後に、サザン分析を用いて、UV誘導損傷の導入前および導入後のさまざまな時点における、複製DNA断片に関連するDNA構造を可視化します。最終的に、この手順を用いることで、特定の変異体においてDNA病変を処理できないことが、DNA修復中間体の蓄積を招くことを示すことができます。

こんにちは、アーサー・イアンです。ポートランド州立大学のCorella Labに所属しています。こんにちは、ブランド・シーです。私もCorella Labのメンバーです。

本日は、二次元ゲル電気泳動の手順について解説します。当研究室では、DNAの複製および修復中間体を研究するためにこの手法を用いています。それでは始めていきましょう。

本手順を開始するには、アンピシリンを含むDGC thigh培地を用い、37 °CでプラスミドPBR 3 22を保持するe coliの200 µLオーバーナイト培養を行います。DGC thigh培地を使用することで、UV遮蔽を最小限に抑えることができます。一晩の培養後、14,000 ×gで30秒間遠心分離し、細胞をペレット化します。

次に、細胞ペレットをアンピシリンを含まない200 µLのDG C mediumに再懸濁し、接種します。アンピシリンによる選択を行わずに、20 mLのDG C mediumを用いて、37 °Cの振盪インキュベーターでOD 600が0.5（約5 × 10⁸ cells/mLに相当）になるまで培養します。アンピシリンなしで増殖させることで、一部の変異株で生じ得る、異常な、あるいは非生産的な複製中間体に対する選択圧を避けることができます。

さらに、UV光を用いて損傷を誘導する場合、アンピシリンはこれらの波長を強く吸収して遮蔽するため、培地からアンピシリンを除去する必要があります。これにより、細胞が成長している間の実効UV線量を低下させます。UVCフォトメーターを使用して、15 Wの殺菌ランプから、1 m²あたり毎秒約1 J/m²sの照射率となる距離を決定してください。

UV照射後、フォトリアーゼによるシクロブタンピリミジンダイマーの光回復による復帰を防ぐため、以降のステップは黄色光の下で実施してください。目的の細胞密度に達したら、ピペットを用いて培養物を回転台上の直径15 cmのペトリ皿に移し、細胞集団全体に均一に照射されるようにします。次に、培養物を50 J/m²で照射し、直ちに滅菌済みの予熱済みフラスコに移して、37 °Cの振盪インキュベーターに戻してください。

実験期間中、この線量により、検討対象となる各時点において、1本鎖DNA 4.5kbあたり平均1個のシクロブタン型ピリミジン二量体が生成されます。培養液 0.75mLを、氷冷したNET 30バッファー 0.75mLにピペッティングして加えます。NET 30バッファーは、複製およびヌクレオチド除去修復の進行を阻止するストップバッファーとして機能します。

ストップバッファーを添加した後、サンプルはタイムコースが終了するまで氷上で保持できます。タイムコース終了後、各サンプルをペレット化し、ペレットを再懸濁します。150 µLのライシスバッファーを用い、撹拌せずに37 °Cで20分間細胞を溶解させます。

一本鎖領域や分岐点を持つ複製構造はせん断に弱いため、カミソリでピペットチップの先端を切り落として開口部を広げ、せん断力を最小限に抑えてください。一般的に、制限酵素によるDNA消化が完了するまでは、ピペッティングや撹拌は最小限にとどめる必要があります。溶菌後、プロテイナーゼKとサルコシルを加え、さらに1時間インキュベートします。これにより、タンパク質に結合しているDNA断片を遊離させます。

活発に複製しているDNAは多くの場合、タンパク質や膜複合体に結合しているため、この操作により複製断片の収量を高めることができます。1時間後、各サンプルに2容量のフェノールを加え、チューブを5分間ゆっくりと転倒混和してサンプルを抽出します。次に、2容量のクロロホルム・イソアミルアルコールを加え、さらに5分間ゆっくりと転倒混和します。

次に、マイクロ遠心分離機を用いてサンプルを14,000 RPMで5分間遠心分離し、各サンプルの上層にある水相を新しいチューブに回収します。その後、4倍量のクロロホルム・イソアミルアルコールを加え、再びチューブを5分間緩やかに転倒混和します。サンプルを再度14,000 RPMで5分間遠心分離します。

ビーカーに入れた250 millilitersの0.1 xteの上に透析膜を置き、各サンプルの100 microlitersを膜上に滴下します。透析後、サンプルを1時間透析させます。各サンプルの80 microlitersを、20 microlitersの酵素ミックスを含む新しい1.5 milliliterチューブに分注します。

サンプルを37 °Cで一晩消化させます。PV twoは、複製起点直後の部位でプラスミドを直線化します。アガロースゲルにロードする前に、100 µLのクロロホルムと、ブロモを含む6xローディングダイを20 µL添加します。

各サンプルにフェノールブルーとキシレンシアンを加え、クロロホルムで混合します。これにより、DNA末端に結合して残っているPV2が除去されます。制限酵素処理したDNAサンプルを1次元目に泳動し、2次元アガロースゲル分析を開始します。まず、あらかじめ作製した0.4%アガロースゲル（1×TBE）の第1レーンに、Lambda Hind IIIサイズマーカーをロードします。

次に、各サンプルのローディングダイを含む水相を 40 µL ずつロードします。この際、後のゲル切り出しを容易にするため、レーンを飛ばしてロードしてください。電気泳動では、1 V/cm の電圧で約 12 〜 15 時間、一次次元の泳動を行います。低電圧および低濃度の AGROS ゲルを用いることで、主にサイズに基づいた DNA 断片の分離が可能となります。

1次元目の電気泳動後、大きなブッチャーナイフを使用して、Lambda Hind III マーカーを含む第1レーンを切り出し、臭化エチジウムで染色します。2次元目のために、Lambda Hind III マーカーをガイドとして、大きなブッチャーナイフを用いてゲルのレーンを切り出し、各レーンの線状プラスミドの予想泳動位置より下の領域を切り取って廃棄します。2次元目のゲルを作製するには、切り出した各スライスを空のゲルキャスターの上部に水平に配置します。

XTBEを用いて1%AROS溶液を調製し、55°Cまで冷却します。冷却後、ゲル溶液を注いで2次元目をキャストし、ゲルのスライスが完全に覆われていることを確認してください。ゲルを注ぐ前に、スライスが均等に配置され、キャスターが水平であることを確認することが重要です。

ゲルが凝固した後、バッファーを再循環させることができる電気泳動装置を用いて、6.5 V/cmで5時間30分から7時間、2次元目（第2次元）の泳動を行います。高電圧および高濃度のAgroseゲルにより、DNA断片はサイズだけでなく形状に基づいて効果的に分離されます。非線形な形状の断片は、泳動後の2次元目において移動速度が遅くなります。ゲルを水で1回すすぎ、その後、400 mLの0.25 M塩酸中で緩やかに撹拌しながら15分間、2回洗浄します。

酸洗浄は、DNA分子を部分的にニックしてより小さな断片に分断するために行います。これは、DNA複製中間体のサイズが大きく形状が特殊であるため、サザン分析における転写効率を高めるために必要です。アルカリ転写に向けてゲルを準備するには、ゲルを再度水で洗浄し、次いで0.4 molar 水酸化ナトリウム 400 millilitersで30分間、2回洗浄します。その後、本手順の記述部分に記載されている通り、0.4 molar 水酸化ナトリウムを用いた下方アルカリ転写システムを使用して、ゲル内のDNAを高結合nプラスナイロンメンブレンに転写します。DNAの転写を6〜12時間行い、転写完了後に記述プロトコルに従ってプローブハイブリダイゼーションを継続します。

メンブレンのプローブおよび洗浄が完了したら、液体が目に見えて消失するまで、メンブレンをペーパータオル上に置いておきます。次に、メンブレンをポリ塩化ビニル（PVC）製ラップで包み、ホスホイメージャースクリーンに密着させます。最後に、Storm 840および付属のImageQuantを用いて、放射活性の可視化および定量を行います。

2Dアガロースゲル分析により観察された、制限酵素で消化したPBR 3 22プラスミドの移動パターンを図示します。非複製の線状プラスミドは4.4 KBの線状断片として移動し、複製プラスミドはY字型の構造を形成します。複製プラスミドは、そのサイズが大きく非線形な形状であるため、非複製断片よりも移動速度が遅くなります。この移動パターンは、UV照射後、線状領域からウェルに向かって伸びる弧を描きます。

二重Y字型またはX字型の分子がコーン領域で観察され、Y字型分子のアークよりも緩やかに移行します。P 32標識PBR 3 22でプローブした2Dゲルのサザン解析の例を、UV照射直後の細胞およびUV照射15分後の細胞について示します。放射線照射後、細胞が対数増殖期で急速に成長しているとき、全プラズマDNAの約1%がYアークに認められます。

損傷部位に停止した複製フォークが蓄積するにつれて、YS形状の分子の一時的な増加が観察されます。また、L字型の複製中間体も一時的に蓄積し、病変が修復される時期と相関して持続します。以上で、二次元ゲル電気泳動を用いてDNA修復中間体を可視化する方法を解説しました。

この手順を行う際は、収量を低下させる原因となるせん断力に注意し、すべてのサンプルとゲルを慎重に取り扱うことが重要です。以上となります。ご視聴ありがとうございました。実験の成功をお祈りいたします。