X -線結晶構造のためのタンパク質の結晶化

本手順の最終的な目的は、X線回折実験に用いるタンパク質結晶を作製することです。結晶スクリーニングのための3つの異なる手法として、ハンギングドロップ法およびシッティングドロップ法を含む蒸気拡散結晶化法、ならびにマイクロバッチ結晶化法について解説します。ウェルには沈殿剤が満たされています。

次に、高濃度の精製タンパク質試料を沈殿剤と混合します。混合した液滴を、沈殿溶液が入ったウェルの中に封入します。ウェルにパラフィンオイルを満たすことで、マイクロバッチ結晶化が開始されます。

次に、タンパク質をウェルにロードし、続いて沈殿剤溶液を加えます。すべての手法における最終ステップは、システムを平衡状態にし、ドロップ内での結晶の出現と成長を追跡することです。最終的に、この手法によって結晶を得ることができ、適切な検出器を備えたX線源を用いてタンパク質の回折パターンを決定することが可能です。

こんにちは。私はイェール大学分子生物物理学・生化学科のYoga Motis教授の研究室のSalです。本日は、精製タンパク質の結晶化の手順について説明します。私たちの研究室では、ウイルス感染の構造的基盤を研究するためにこの手順を用いています。

それでは、結晶作製を開始しましょう。目的のマクロ分子の結晶化手法を特定するために、市販の結晶化溶液を用いた初期スクリーニングを行うことができます。これらの溶液は、試行条件にスパースマトリックス不完全因子法を利用するように選定されています。これらの条件は、マクロ分子において既知であり、一般的に成功している結晶化条件に基づいて選択されています。

結晶化条件が判明したら、元のヒット条件周辺のpHおよび沈殿剤濃度を変化させたナロースクリーンを構築します。通常、これらのスクリーンに使用される結晶化条件は、沈殿剤とpH設定用の緩衝液で構成されます。本デモンストレーションでは、すべてのストック溶液を0.22 micronフィルターでろ過する必要があります。鶏リソソームに対して previously identified された結晶化条件を用い、沈殿剤として塩化ナトリウムを使用します。まず、さまざまなpHの0.1 molar 酢酸ナトリウム溶液に、さまざまな濃度の塩化ナトリウムを溶解させた1 milliliterの溶液を調製して手順を開始します。

次に、-80 °Cで保存されていたタンパク質試料を融解し、氷上に保持します。一般的なタンパク質濃度は 5 ～ 50 mg/mL の範囲であり、通常は濃度が高いほど良好な結果が得られます。ここでは、0.02 M 酢酸ナトリウム（pH 4.9）に溶解した 50 mg/mL の鶏卵リゾシム溶液を使用します。

融解ステップで生じた部分的に凝集したタンパク質や沈殿物を除去するため、サンプルを18,000 G、4 °Cで15分間遠心分離します。これらの凝集塊は結晶成長を妨げ、さらなる凝集を促進する可能性があります。遠心分離後、

UV分光光度計を用いて、280ナノメートルにおける吸光度からタンパク質濃度を決定します。タンパク質濃度は、吸光度の測定値とタンパク質の吸光係数から算出できます。タンパク質サンプルが準備できたら、トレイマップに従って、24ウェルのハンギングドロップ法用結晶化トレイに沈殿剤溶液を500 µLずつ満たします。

各ウェルの縁にシリコングリースでリングを作成します。この際、ウェル上部の空気が抜けるよう、リングを完全に閉じないようにしてください。カバースライドをエアダスターまたは専用のワイプで清浄し、埃を除去します。これにより、結晶化ドロップの判定が容易になり、コンタミネーションを防ぐことができます。次のステップとして、タンパク質試料とリザーバー溶液を等量ずつカバースライド上にピペッティングします。

ただし、最適化プロセスの一環として、タンパク質と沈殿剤の異なる容量を試すことができます。沈殿剤よりも多くのタンパク質を使用すると、平衡状態の液滴におけるタンパク質の正味濃度が高くなり、希薄なタンパク質試料の場合や、結晶の核形成または成長を遅らせたい場合に有効な場合があります。本デモンストレーションでは、0.02 M 酢酸ナトリウム（pH 4）に溶解した 50 mg/mL リゾチーム 2 µLをカバーガラスの中央に分注し、続いて結晶化溶液 2 µLを加えています。

カバースライドにタンパク質とリザーバー溶液をピペッティングする際は、ピペットから空気が押し出される際に発生しやすい気泡の形成に細心の注意を払ってください。液滴内での局所的な沈殿剤濃度の過剰上昇によるタンパク質の早期沈殿を防ぐため、ピンセットを用いて液滴を静かに混ぜ合わせます。特にポリエチレングリコールのような粘性の高い沈殿剤を使用する場合、この混合操作は非常に重要です。カバースライドを静かに反転させ、ウェル上部のグリスリングの上に載せます。この際、ウェル内の空気が逃げるように、方向性を持たせて置いてください。

そうしないと、空気がカバーガラスを押し上げ、ウェルの密閉性が損なわれる可能性があります。トレイ全体が完了するまで、次のウェルへと進んでください。トレイのセットアップが完了したら、目視で点検し、タンパク質結晶の誤検出の原因となる塵埃やその他の汚染物質を除去してください。

スコアシートを用いて実験内容を記録します。次に、トレイを目的の培養温度（一般的に4 °Cから室温の間）に設置します。最も適した温度は20 °Cです。

トレイの移動やインキュベーション中は、トレイを慎重に扱い、振動や温度変化を避けるようにしてください。これらは結晶の成長を妨げたり、結晶の品質に悪影響を及ぼしたりする可能性があります。翌日以降、数日おきにトレイ内の結晶を確認してください。その際、常にトレイの取り扱いには注意してください。観察結果および液滴の形態は、トレイ専用のスコアリングシートに記録してください。

結晶は通常2～5日で現れますが、ほぼ即座に現れる場合や、数ヶ月後になる場合もあります。結晶化条件が特定され、結晶の成長速度が判明した後は、結晶が現れ、最終的なサイズの少なくとも半分になるまで、トレイを動かさずにそのままにしておくのが最善です。トレイを静置することで結晶の核形成回数を減らすことができ、結果として、より少数の大きな結晶を得ることが可能になります。シッティングドロップ法による結晶化は、カバーガラスを必要としない24ウェルのシッティングドロップ用トレイを使用する点を除き、ハンギングドロップ法と同様の手順で行います。

代わりに、ウェル内にはタンパク質と沈殿剤を混合するためのシェルフがあります。ピペットを用いて、気泡が発生しないように注意しながら、50 mg/mLのリゾチーム溶液 2 µLをシェルフの中央に分注します。次に、トレイのセットアップ後、サンプルに沈殿剤溶液 2 µLを加えます。シッティングドロップ法を用い、ウェルを光学テープで密封します。

カバーガラスは不要です。ハンギングドロップ法で説明した通りに、インキュベーションと結晶のスコアリングを続けてください。マイクロバッチ法を行う場合は、以下の手順に従ってください。

ハンギングドロップ法の手順に従って、結晶化溶液とタンパク質を調製します。新しいマイクロバッチトレイを用意し、エアスプレーで清掃して、トレイ内にほこりやその他の大きな粒子が混入するのを防ぎます。各ウェルにパラフィンオイルを3 mmの深さまで加えます。

その後、余分なオイルを除去します。次に、タンパク質溶液1 µLをあらかじめ充填されたウェルにロードし、液滴がウェルの底に沈むようにします。その後、沈殿剤溶液1 µLをウェルにロードします。

液滴がウェルの底に沈み、タンパク質液滴と融合したことを確認してください。トレイの全ウェルが完了するまで次のウェルへ移動し、ここに記載されているインキュベーションと結晶解析を続けてください。タンパク質結晶化の代表的な結果。

実験結果を示します。タンパク質および／または沈殿剤が高濃度である場合、無定形沈殿が生じます。逆に、不飽和状態の液滴は通常、透明なままです。

高濃度の特定の沈殿剤と混合した際に、タンパク質または界面活性剤が別の相に分離する場合、相分離が起こることがあります。最適な条件下では、Arabidopsis csnのタンパク質結晶が形成されるはずです。ポリエチレングリコール 8,000および酢酸マグネシウムで得られた7つのタンパク質結晶は、棒状に現れます。

合わせて示されているのは、1 Mの塩化ナトリウムおよび酢酸ナトリウム、pH 4.9で得られたリソソームタンパク質の結晶です。このタイムラプス動画では、ハンギングドロップ法を用いた場合、リソソーム結晶がセットアップから数時間以内に大きなプリズム状に成長することが示されています。

本手順におけるタンパク質実験のセットアップ方法について説明しました。液滴の蒸発を最小限に抑えるために、温度と湿度が安定して管理された環境で作業することが重要です。また、液滴が外気にさらされる時間を最小限に抑える手法を検討してください。そのため、整理整頓された作業環境で操作を行うことが不可欠です。

以上です。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りいたします。