電気化学センサを用いた細菌検出＆識別

本実験の全体的な目的は、電気化学センサーを用いて細菌を検出および同定することである。まず、細菌からリボソームRNAを遊離させてフッ素化検出プローブとのハイブリダイゼーションを可能にし、次に、検出プローブが結合したリボソームRNAを作動電極に添加することで、センサー表面の捕捉プローブとのハイブリダイゼーションを行わせる。その後、抗フルオレセイン horseradish peroxidase 複合体を、フッ素化検出プローブに結合させる。

最終的に、センサー表面上のキャプチャープローブ・リボソームRNA検出プローブ複合体の数に相関する干渉電流の強度を得ることができます。培養法に対するこの手法の主な利点は、細菌を約45分で検出および同定でき、EDGARプレート上で細菌が目に見えるコロニーを形成するまでの一晩の待機時間を回避できることです。この手法の応用は、感染症の管理を改善させるでしょう。

細菌性病原体の早期検出は、標的を絞った抗菌薬治療および臨床転帰の改善にとって不可欠です。この手法は感染症の診断に有用であるだけでなく、免疫診断などの他の診断上の課題にも適用可能です。まず、キャプチャープローブのチオール基が確実に還元され、結果の再現性が高まるように、希釈したキャプチャープローブをヘキサンジチオールとともに室温で10分間インキュベートします。

インキュベーション後、窒素気流を金センサアレイチップに5秒間当て、水分や微粒子を除去します。センサアレイの作用電極には、少量の液体を慎重に滴下する必要があります。この手法の視覚的なデモンストレーションが極めて重要です。

ピペッティング、洗浄、および乾燥の手技を適切に行うことで、チップ間のばらつきを大幅に低減できます。次に、HDT希釈キャプチャープローブ混合液 6 µLを、センサーアレイの全16個のセンサーの作用電極に滴下し、センサーチップをカバー付きペトリ皿に入れ、4 °Cで一晩保存します。翌日、センサーチップを脱イオン水で2～3秒間洗浄し、その後、窒素気流下で5秒間乾燥させます。続いて、attri hydrochloride sodium chloride, EDTA MERCAPTOETHANOL溶液 6 µLを全16個のセンサーの作用電極に滴下し、ペトリ皿を用いて室温で50分間インキュベートします。

電気化学センサーアッセイ用の試料を調製します。対数増殖期の細菌培養液 1 mL をマイクロ遠心チューブに移し、16,000 ×g で 5 分間遠心分離します。なお、病原性細菌はバイオセーフティフード内で取り扱ってください。

スナップキャップを取り外した後、1 M 水酸化ナトリウム 10 µL を含むピペットチップをマイクロ遠心チューブの底部に当て、数回ピペッティングしてペレットを完全に再懸濁させます。懸濁液を室温で5分間インキュベートした後、牛血清アルブミン（BSA）およびフルオレセイン修飾検出プローブを含むPBS 50 µL を加え、細菌溶解物を中和します。その後、中和した溶解物を室温で10分間インキュベートします。

まず、準備したセンサーチップのうち1枚からメルカプトエタノール溶液を脱イオン水で2～3秒間洗浄します。先ほど実演した方法でチップを乾燥させた後、中和した細菌溶解物を作用電極に4 µL滴下します。センサーの14番です。

次に、PBS、BSA、およびフルオレセイン修飾検出プローブを含むブリッジングオリゴヌクレオチド 4 µLを、2つの陽性コントロールセンサーに適用します。その後、ライセートおよび陽性コントロールセンサーを15分間インキュベートし、前述と同様にセンサーチップ全体を洗浄して乾燥させます。続いて、カゼインを含むPBSに溶解した抗フルオレセイン西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）4 µLを、全16個のセンサーの作用電極に適用します。

15分間のインキュベーション後、センサーチップを洗浄し、乾燥させます。次に、センサーチップの表面にフィルムウェルステッカーを貼り、チップをセンサーチップマウントにセットします。すべての16個のセンサーにTMB基質を50 µLずつ分注し、センサーチップマウントを閉じます。最後に、Heliosチップリーダーを使用して、16個すべてのセンサーのパイロメトリーおよびサイクリックテレメトリーの測定を行います。

上述の電気化学アッセイは、この図に示すように、サンドイッチ型ELISAと同様の構成となっています。標的リボソームRNAとキャプチャープローブおよび検出プローブとのハイブリダイゼーションは、検出プローブ上の3'末端フルオレセイン結合部に結合する抗フルオレセイン抗体フラグメントに結合したHRPによって触媒される還元反応により検出されます。アッセイの感度を決定する重要な要素は、金電極の表面化学です。金電極はメルカプトエタノールと1-ヘキサデカンチオールでコーティングされ、希釈したキャプチャープローブを添加することで機能化されています。

標的リボソームRNAとキャプチャープローブおよびフルオレセイン標識検出プローブとのサンドイッチハイブリダイゼーションにより複合体が形成され、これを抗フルオレセイン西洋わさびペルオキシダーゼ複合体とTMB基質の添加によって検出します。Mパラメータ電流は、西洋わさびペルオキシダーゼによるTMBの酸化と、電極からの電子によるTMBの還元からなる還元酸化サイクルによって生成されます。本アッセイでは、Gene Fluidic 16 センサーアレイチップを使用しています。

アレイ内の各センサーには、作用電極、参照電極、および対極の3つの電極が含まれており、チップの端に接点があります。チップリーダーには、各接点に接続するポゴピンが備わっています。このチップリーダーは、コンピューターアルゴリズムによって制御されるポテンショスタットとセンサーアレイとのインターフェースとして機能します。

ここでは、電気化学センサの電流フローの例を示します。パラメータ測定の開始後、最初の数秒間はセンサ内の電流フローが人為的に高くなります。TMBをセンサ表面に適用してからリーダーアルゴリズムを開始するまでの間に酸化基質が蓄積するため、その後電流フローは速やかに定常状態に達し、60秒以内に信頼性の高い正確なセンサ読み取り値を得ることができます。

センサー間のばらつきは比較的一定であるため、Gene Fluidic 16センサーアレイチップを用いて16種類の異なるセンサーアッセイを並行して実施することが可能です。陽性コントロールと陰性コントロールは不可欠であり、陽性コントロールとしては、キャプチャープローブとディテクタープローブの両方にハイブリダイズし、既知濃度の合成ターゲットとして機能する合成ブリッジングDNAオリゴヌクレオチドを使用します。このブリッジングオリゴヌクレオチドを用いて得られた結果は、チップ間のばらつきを最小限に抑えるための内部校正コントロールとして機能します。

電極の負電流が大きいほど、信号が高くなります。キャプチャプローブおよび検出プローブをテストする際、検出限界は、この図に示すように既知濃度のサンプルの連続希釈によって決定されるべきであり、アッセイのダイナミックレンジにおいてサンプル濃度と信号出力の間に線形のlog-log相関が認められます。

これらの棒グラフでは、尿路感染症患者の尿に頻繁に見られる Escherichia coli、Klebsiella pneumoniae、およびアンモニアを含むサンプルの代表的な結果を示しています。ほとんどのセンサーのシグナルは低く、同様の結果となります。これらの陰性結果はバックグラウンドシグナルとしてまとめられ、KEプローブペアによる反応性は、E. coliとそれ以外の菌を区別します。ブリッジングオリゴヌクレオチドは、陽性対照および内部校正標準として機能します。この手法は、抗生物質に対する細菌の表現型応答を測定することにより、臨床検体中の薬剤耐性菌の検出に適用することが可能です。

この手法は、個々の患者にとって最適な治療法を決定するために活用できます。このビデオを視聴することで、チップ内の異なる種特異的センサーにおける電流を比較し、細菌を検出および同定する方法について十分に理解できるはずです。