マイクロインジェクションによる哺乳動物細胞におけるmRNA核外輸送の速度論の解析

本手順の全体的な目的は、哺乳類細胞におけるmRNA核外輸送のキネティクスを測定することです。これは、まず哺乳類組織培養細胞の核内にmRNAまたはDNAをマイクロインジェクションすることによって達成されます。マイクロインジェクション後、さまざまなインキュベーション時間を経てサンプルを固定します。

次に、蛍光in situハイブリダイゼーション（FISH）によりmRNAを染色します。本手順の最終ステップは、細胞をイメージングし、細胞質および核内の蛍光量を定量することです。最終的に、マイクロインジェクションと蛍光顕微鏡法を組み合わせることで、mRNAの輸送速度を測定することが可能です。

こんにちは、トロント大学生化学科のAlex Palazzo研究室のSRG AVです。同じくPalazzo研究室のStefan Toskiです。Palazzo研究室のAmyです。そして、Palazzo研究室のKhi Maha Davidです。

本日は、マイクロインジェクションを用いて哺乳類の培養細胞の核内にmRNAを導入する手順を紹介します。また、蛍光in situハイブリダイゼーションによるmRNAの染色方法についても実演します。当研究室では、これらの手法を用いて、哺乳類細胞におけるmRNAの核外搬出のキネティクスを研究しています。

それでは始めましょう。マイクロインジェクションに先立ち、あらかじめ調製したプラスミドDNAをインジェクションバッファーで50から200 µg/mLの濃度に調整します。次に、注入された細胞を識別できるように、Oregon Green 488（OG）を結合させた70 kDaデキストランを混合液に加えます。

OG結合デキストランを用いることで、注入液のどれだけが核内に注入され、どれだけが細胞質に漏出したかを判断できます。粒子状の物質が針先を塞ぐ可能性があるため、サンプルを13,000 G、4°Cで少なくとも20分間遠心分離します。書面によるプロトコルの基準に基づき、マイクロインジェクションを行う哺乳類細胞株を選択してください。

このデモンストレーションシードでは7つの細胞を使用します。マイクロインジェクションの少なくとも24時間前に、30 millimeterのペトリ皿内の酸洗浄済みカバースリップ上に細胞を配置します。インジェクション時に注入した細胞を容易に識別できるよう、細胞単層はおよそ70から90%コンフルエントであることが理想的です。インジェクションの前に、200 microliterのプラスチック製ピペットチップを用いて細胞単層に傷をつけます。

カバースリップに十字の傷をつけ、注入前に組織培養インキュベーター内で少なくとも15分間、細胞を回復させます。マイクロインジェクションには、マイクロインジェクション工程を妨げる振動を最小限に抑えるため、エアテーブル上に設置された倒立顕微鏡を使用してください。Einorゲルローダーチップを用いて、ペレットを乱さないよう、遠心分離サンプルの上部から約1 µLを回収します。

ピペットのチップをあらかじめ作製したマイクロインジェクション針の後端に挿入し、液体を吐出します。液体は毛細管現象によって針先へと吸い込まれます。5秒から30秒以内に、針先の近くにメニスカスが確認できるはずです。

液体が充填された針をワンドに装着し、マイクロマニピュレーターで固定します。10倍対物レンズを使用して針を視認し、焦点面付近の視野中心に45度の角度で配置します。粗動マイクロマニピュレーターのノブを使用して調整します。ワンドはチューブでガラス製シリンジに接続されており、このシリンジを用いて針先から液体を噴出させるために必要な圧力を生成します。

圧力を一定に保つため、シリンジをパイプクランプに固定します。2つのゴム栓と2つのメタルクランプを使用して、後の工程で針が損傷しないよう数ミリメートル持ち上げ、その後、顕微鏡を後方に下げます。ピラー、シリンジプランジャーを押し下げて圧力を上げます。

0.5から2 cm³まで。傷をつけた単層のカバーグラスを入れたペトリ皿を配置します。観察ステージ上で、顕微鏡を後方に引きます。

ピラーを直立位置まで前方に移動させ、コンデンサーを調整してニードルが液体に入るように合わせます。この操作は、カバーガラスでニードルが破損しないよう、慎重に行ってください。10倍対物レンズを使用して、クロス wounds の中心を特定し、注入対象となる細胞の上にニードルを配置します。

対物レンズを40 xに切り替えて倍率を上げます。次に、ジョイスティックの微動調節ノブを使用して、針を下げて中心に合わせます。創傷断面の一角に針を下げて核に接触させ、注入を開始します。

注入されると、細胞の位相輝度に顕著な変化が現れます。創傷十字の一辺に沿って進めてください。可視化の際に注入細胞を容易に識別するためには、各ニードルに合わせて注入圧を適切に調整することが極めて重要です。

圧力は、細胞質膜および核膜を貫通させるのに十分な強さである必要がありますが、細胞を死滅させるほど高くしてはいけません。傷口の縁に沿って、一定時間マイクロインジェクションを行います。習熟すれば、この時間内に数百個の細胞に注入することが可能です。

プラスミドDNAを注入した場合、固定前にマイクロインジェクションした細胞を組織培養インキュベーターにて37 °Cで20分間インキュベートし、その後、転写を停止させます。細胞を、増殖培地に溶解した1 µg/mLのα-アマニジンで処理してください。この濃度で、マイクロインジェクションされたプラスミドからの転写を効果的に抑制できます。

細胞をインキュベーターに戻し、新たに合成されたmRNAを細胞外へ排出させます。1本の針を使用して、複数のカバーガラスに注入することが可能です。ただし、マイクロインジェクションに用いるDNAまたはRNAの種類を変更する場合は、針を交換する必要があります。

さらに、mRNAの核外輸送速度を正確に測定するため、ニードルをワンドから外した後は廃棄してください。0分、15分、30分、60分、120分の各時点で、それぞれ独立したサンプルを固定します。適切な時間にalpha manin処理を行った後、培地を吸引し、2 mLのPBS溶液で細胞を2回洗浄します。

カバーガラスが液体に浸かっていない時間を最小限に抑え、湿った状態に保つことが重要です。PBSで調製した4% Aldehydeを2 mL加え、室温で少なくとも15分間インキュベートして細胞を固定します。固定したサンプルをさらに2回洗浄した後、PBSで調製した0.1% Triton X 100を2 mL加えて細胞を透過処理し、同様に室温で少なくとも15分間インキュベートします。

最後に、ハイブリダイゼーションの準備として、サンプルをさらに2回洗浄します。25〜60% formamideを含む1X SSC溶液の洗浄バッファーで細胞を2回洗浄してください。次に、150 mmのペトリ皿の底を水で満たし、その上にparaformを浮かべて、ハイブリダイゼーション用の染色チャンバーを準備します。

ディッシュを逆さまにして水を取り除き、パラフォームをディッシュの底に付着させます。染色する各カバーガラスの気泡を手作業で取り除きます。ハイブリダイゼーション溶液を100 µLずつ、パラフォームの上にピペットで滴下します。

使用する特定の魚類細胞に合わせて、ホルマゲの量を最適化することに注意し、ピンセットを用いて操作してください。30 mmのペトリ皿から、固定細胞が載ったカバーガラスを取り出します。ワットマンろ紙を用いて、カバーガラスの裏面を乾燥させ、細胞を乾燥させないようにしながら、表面の余分なバッファーを吸い取ってください。

次に、カバーガラスを魚溶液の上に伏せて置きます。この工程をすべてのカバーガラスに対して繰り返します。染色チャンバーの蓋を戻した後、サンプルを37 °Cで5〜18時間インキュベートします。

染色チャンバーと同様の手順で、いくつかの洗浄チャンバーを準備します。各カバーガラスに対し、洗浄チャンバーのパラフィルム上に洗浄バッファーを1 mLピペッティングします。インキュベーション後、洗浄バッファーを1 mLピペッティングして、染色チャンバーからカバーガラスを取り出します。次に、毛細管現象によって、カバーガラスの横から各サンプルの下に液体が引き込まれるようにします。

次に、ピンセットでカバーガラスを取り除き、室温で5分間インキュベートした洗浄バッファーの液滴の上にそれぞれ置きます。各カバーガラスをさらに2回洗浄し、計3回の洗浄を行います。あらかじめ洗浄したスライドガラス上に、DAPIを含む封入剤を10〜30 µLピペットで滴下します。ピンセットとWhatmanフィルターペーパーを使用し、1枚のスライドガラスに2枚のカバーガラスを載せることができます。

カバーガラスの背面を乾燥させ、サンプルを乾かさないように注意しながら、カバーガラス前面の余分な液体を吸い取ります。各カバーガラスを、封入剤の滴の上に裏向きに置きます。封入したサンプルは4 °Cで保存可能です。

ここでは、異なる濃度のalpha mantinで前処理したNIH 3T3線維芽細胞を用いて、注入されたプラスミドDNAの転写に対するalpha mantinの影響を示しています。これらの細胞にTFL s delta iプラスミドDNAおよびOG結合70 kDaデキストランを注入しました。各行は、OG 70 kDaデキストランおよびT uts delta I mRNAを撮影した単一の視野に対応しています。

薬物の高濃度条件下ではT UTS delta I転写物の産生が完全に抑制された一方で、低濃度ではこの現象は見られなかったことが明らかになりました。ここに、mRNAの核外輸送のタイムコースを示します。7つの細胞にT UTS delta iプラスミドDNAおよびOG接合70 kilodaltonデキストランを注入しました。

細胞注入30分後、細胞をalpha mantinで処理し、37 °Cで0分、60分、120分間インキュベートしました。その後、細胞を固定し、T UTS delta I mRNAに対するプローブおよびERマーカーであるtrap alphaに対する抗体で染色しました。各行はそれぞれ単一の細胞視野に対応しています。

mRNA輸出の定量方法に関する詳細については、こちらのオンラインテキストをご参照ください。120分時点の画像を拡大しました。ERにおけるTFS delta I mRNAの共局在を示すため、緑色のT UTS delta I mRNAと赤色のtrap alphaを重ね合わせて表示しています。mRNAとタンパク質を共染色する方法については、オンラインテキストでご確認いただけます。

マイクロインジェクションによるmRNAの核外輸送キネティクスの測定方法について説明しました。この手順を行う際、マイクロインジェクションを成功させるには適切な準備が重要であることを忘れないでください。DNAおよびRNAの調製、サンプルの調製、ニードルの引き出し、光学機器の調整、およびマイクロインジェクションのトラブルシューティングなどの重要なステップについては、記述プロトコルに記載されています。

マイクロインジェクションで導入したmRNAのイメージングおよび解析を行う際は、注入液の90%以上が核内に導入された細胞のみを定量対象とすることが重要です。核への注入が成功したかどうかは、核および細胞質におけるOrgan Green Dextranの分布を可視化することで評価できます。魚類用プローブの設計および、核と細胞質におけるmRNA分布の解析に使用する画像解析ソフトの詳細については、オンラインプロトコルをご参照ください。

以上です。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りいたします。