単一粒子のためのマイクロ流体ベースの流体力学的トラップ

本手法の総合的な目的は、マイクロ流体デバイス内の層流を用いて、単一のマイクロおよびナノスケール粒子を閉じ込め、操作することです。この流体力学的トラップは、クロススロット型の流路形状を持つマイクロ流体デバイスで構成されており、これによりマイクロチャネルの接合部で停滞点流れが生じます。流出チャネルの1つに配置されたオンチップバルブを使用して、流体フローを能動的に制御し、粒子をトラップします。

よどみ点の位置を能動的に制御することで、粒子をユーザーが定義した設定点に閉じ込めます。フィードバックコントローラーを使用して粒子の位置を追跡し、オンチップバルブを調節して粒子を設定点に維持します。この流体トラップを用いることで、低濃度または高濃度の粒子溶液から単一粒子を捕捉し、蛍光顕微鏡または明視野顕微鏡を用いて撮像することが可能です。

粒子軌跡およびトラップ中心からの粒子変位のヒストグラムに示されているように、単一粒子をトラップ中心から1 micron以内に閉じ込めることができます。こんにちは、イリノイ大学の化学・バイオ分子工学科、および生物物理学・計算生物学センターにあるチャールズ・シュローア教授の研究室のエリック・ジョンソン・リオです。こんにちは、シュローア研究室の博士研究員のアリです。

こんにちは、シェリル・シュローダーです。本日は、単一粒子の流体力的トラッピングのためのマイクロ流体デバイスの作製と実装方法について解説します。光学トラップや電気動力学的トラップなどの既存の手法と比較した本手法の主な利点は、流体フローのみによって流体力的トラッピングが達成されるため、ナノ粒子や細胞のトラッピングにおいて潜在的に有害な外場を排除できる点にあります。この技術は、トラップされる粒子の化学的または物理的特性に依存せず、マイクロおよびナノスケールの粒子を自由溶液中でトラップすることを可能にし、基礎科学および応用科学を変革させる可能性を秘めています。

それでは始めていきましょう。SU-8モールドからレプリカを剥がしやすくするため、数滴のトリクロロシランを入れたガラス皿とともに、ウェハを真空デシケーターに入れて10分間処理し、SU-8モールドの表面を処理します。流体層と制御層には、混合したDGAs PDMSを使用します。15:1に混合したPDMSを流体層モールド上に750 RPMで30秒間スピンコートし、その後、ウェハをシャーレに入れます。

同様に、コントロール層のモールドをシャーレに入れ、PDMS混合液（5:1）を厚さ 4 mm になるまでモールドに流し込みます。PDMS層を部分的に硬化させるため、ウェハーおよびPDMSを 70 °C で 30 分間加熱し、室温まで冷却します。スカルペルでPDMSレプリカを切り出し、SU-8モールドから剥がします。

次に、21ゲージの針を用いて、オンチップ膜バルブとして機能するマイクロチャネルへのアクセスポートとなる穴をPDMSに開けます。コントロール層を備えたPDMSレプリカを、PDMS流体層をスピンコートしたウェハの上に配置します。実体顕微鏡を使用して、コントロール層を流体層に慎重に合わせ、密封します。

層の間に気泡が残らないように注意し、70 °Cで一晩加熱して完全に硬化させ、室温まで冷却した後に2層構造の単一のPDMSスラブを作成します。メスを使用して、SU-8モールドからPDMSレプリカを切断して剥がし、カミソリで余分なPDMSを取り除いて各デバイスユニットを切り離します。次に、21ゲージの針を用いて、流体層のマイクロチャネルへのアクセスポートをホールパンチで開けます。カバーガラスをアセトンとIPAで洗浄し、窒素で乾燥させます。

カバーガラスとPDMSレプリカの両方の表面を、500 millitorrで30秒間、酸素プラズマ処理します。その後、すぐに2つの表面を接触させ、不可逆的なシールを形成させます。最後に、デバイスを一晩ベイクし、PDMS層とカバーガラスの間の接合性を高めます。

まず、マイクロ流体デバイスを倒立顕微鏡のステージ上に配置し、ステージクリップで固定します。次に、マイクロ流体デバイスに溶液を供給するため、1 mLおよび250 µLのガスタイトシリンジに、それぞれバッファー溶液とサンプル溶液を満たします。サンプルシリンジとマイクロ流体デバイスのサンプルポートの間にTバルブを使用し、サンプルの供給を制御します。

次に、パーフルオロオキシチューブ、ルアーロックアダプター、および24ゲージの金属チューブを用いて、シリンジとマイクロ流体デバイス間の流体接続を行います。続いて、PFAチューブと24ゲージの金属チューブを用いて、マイクロ流体デバイスの出口チャネルの流体接続を行います。シリンジと出口チャネル間の圧力降下を一定に保つため、出口側のPFAチューブは等長にし、両方をバッファー溶液を満たした1.5 milliliter遠心チューブの中に浸しておきます。

操作中に流体層へ空気が漏れ出すのを防ぐため、3 mLのルアーロックプラスチックシリンジを用いて、オンチップバルブにフッ素系キャリアオイルを満たします。バルブ室内の空気をPDMSメンブレンを通して流体層のマイクロチャネルへと押し出します。

オンチップバルブを操作します。コントロール層のポートに加圧不活性ガス供給源を接続してください。流体接続部およびマイクロ流体デバイスを0.5 millilitersの緩衝液で洗浄し、出口チャネルを含むシステム内からすべての気泡が除去されていることを確認してください。

気泡を除去するために使用される一般的な流速は2000から5,000 µL/hの範囲です。マイクロ流路から気泡を洗い出した後、流速を粒子トラッピングに一般的な体積流量である50から100 µL/hまで下げます。次に、Tバルブを切り替えてサンプルをマイクロ流体デバイスに流します。線形フィードバック制御アルゴリズムを実装し、粒子トラッピングを自動化するカスタム構築のLabVIEWコードを実行します。

このコードはCCDカメラから画像をキャプチャし、オンチップ空気圧バルブの位置を能動的に調節する圧力レギュレーターに電位を送信します。顕微鏡のXYステージを用いて、トラッピング領域をカメラ視野の中心に配置してください。トラッピング領域を対物レンズの焦点内に合わせ、カメラの設定を調整してイメージング条件を最適化します。

カメラの視野内で、ROIの中心がトラップの中心位置となるように矩形の関心領域（ROI）を選択します。次に、オンチップバルブに印加するオフセット圧を初期化します。反対側の出口チャネルには、幅100～200 micronの絞り部が配置されています。

オンチップバルブの動作にオフセット圧を提供します。フィードバックコントローラーを起動し、トラップ応答を最適化するために比例ゲインを調整します。流量とオンチップバルブの位置に応じて最適な比例ゲイン値が存在し、これによりトラップの安定性が向上し、不要な粒子の振動が解消されます。

LabVIEWコードにより、トラッピング領域に進入する粒子のうち1つが自動的に捕捉されます。本ビデオにおいて、流入方向への粒子の動きが生じているのは、流入方向への捕捉精度を最大化するためにサンプル注入ストリームを開放したままにしているためです。ユーザーは捕捉中にサンプルストリームを閉じることができます。これにより、クロスチャネル接合部への流れが均等にバランスされ、捕捉された粒子をモニタリングし、手動フォーカスまたは自動フォーカス顕微鏡装置を用いて画像平面内で粒子のフォーカスを維持することが可能になります。

統合マイクロ流体デバイスは、サンプルフォーカス、クロススロットジャンクション、およびニューマチックバルブで構成されており、トラッピングはクロススロットジャンクションで発生し、粒子位置はニューマチックバルブを介したマイクロチャネルジャンクションにおける流場の能動的な調整によって制御されます。ここでは、単一のビーズが流体力学的トラップに閉じ込められている画像を示します。トラップ中心のビーズに加えて、クロススロットジャンクションのトラッピング領域内にトラップされていない複数のビーズが表示されています。

トラップされた2.2 micronの蛍光ポリスチレンビーズの軌跡をマッピングします。粒子はまず3分間トラップされます。その後、トラップから解放され、流出口チャネルのいずれかに沿って脱出します。

出口チャネル方向に沿ったトラップ中心からの捕捉ビーズの変位を示すヒストグラムから、粒子がトラップ中心から1 micron以内に閉じ込められていることがわかります。本日は、マイクロ流体デバイス内で生成された停滞点流れを用いた、マイクロおよびナノスケール粒子の自由溶液トラッピング手法としてEMトラップを紹介しました。流体力学的トラッピングにより、他の力場ベースのトラッピング法では困難であった、高濃度粒子懸濁液中における単一標的粒子の閉じ込めが可能になります。

さらなる開発が進むことで、この新しい手法は生物物理学、細胞力学、流体力学、酵素学、およびシステム生物学の分野における科学的探究を可能にします。ご視聴ありがとうございました。この手法が皆様の実験に役立つことを願っております。