マイクロ流体デバイスを用いた細胞のキャプチャ

私たちが準備したデバイスは10個または20個入りのキットとしてパッケージ化されており、配送時は保冷ボックスで輸送されます。キットには、実験の実行に必要なすべてのコンポーネントが含まれています。キット内の構成品として、室温で保存可能なすべてのシリンジと緩衝液が入ったパックが含まれています。また、本実験で従うプロトコルのコピーも同梱されています。

また、実際のデバイスと、冷蔵保存が必要なすべてのランニングバッファーが入った冷蔵ボックスもあります。通常、キットは10個または20個のグループで梱包されています。使用しないときは、キットを冷蔵保存してください。

各シリンジおよび各キット構成品には注意深くラベルが貼られており、これらのラベルは手順書に従うテーブルの内容と対応しています。そのため、個々のステップでどのシリンジまたはキット構成品を使用すべきかについて、曖昧さはなくなります。デバイスを梱包から取り出し、生物安全キャビネット内に配置した後、好中球を分離し、後続のゲノム解析への応用のために溶解させる操作を行います。得られた細胞溶解液を用いて分離を行うか、または細胞溶解液からRNAを抽出するためです。

そのため、単に無菌状態であるだけでなく、環境中に通常存在するあらゆるRNAが除去され、作業エリアが清潔な状態であることを確認する必要があります。したがって、RNAを分解する溶液を用いて、作業エリア全体とデバイスを拭き上げることが非常に重要です。通常、RNA SAPやRNAway（複数のメーカーから購入可能です）を使用して、すべての器具と作業面を拭き上げます。

本デバイスはヒートシールポーチに梱包されています。各デバイスは密封されており、バーコードが付与されています。臨床検体を使用して作業を行う場合は、このバーコードを記録しておいてください。

デバイスの封印を解き、カバーを取り外して、ポンプ保持マニホールド装置に設置します。使用する血液試料は全血試料です。これを標準的な1 mLのBDシリンジで流します。このシリンジには「シリンジ1」とラベルを貼ります。

通常は、パッケージからシリンジを取り出し、血液チューブのキャップを慎重に外します。そして、700 µL（0.7 mL）の血液を採取し、その半分である350 µLを1.5 mLチューブに注入します。これにより、血液をさらなる処理に回すことができます。

血液サンプルを採取したチューブを次へ回しても、デバイスの故障に備えて十分な血液が残っている状態になります。それでは、血液が入ったシリンジを、このデバイスに接続されたチューブ付きの針に取り付けます。マイクロ流体分離デバイスの取り扱いには十分注意してください。

デバイス内に気泡が混入すると、デバイスが正常に機能しなくなるため、十分に注意する必要があります。そのため、通常はシリンジを使用してプランジャーを押し、液体をデバイスの上面に加えます。すべての液体を排出する前に、完全に濡れていることを確認してください。そこで一旦停止し、ニードルからシリンジ本体を慎重に取り外し、シリンジ内に残っているバッファーでニードルの先端またはルアーコネクタを満たします。

それを廃棄します。次に、血液の入ったシリンジを取り、このルアーハブに挿入します。この際、血液をこぼさないよう、また気泡が混入しないように注意してください。

血液が漏れた場合に備え、キムワイプでシリンジの本体とチューブを持つのが最適です。シリンジをチューブハウジングまたは針に接続した後、コネクタ部分にある可能性のある気泡を取り除くために、数回軽く叩きます。その後、このシリンジをシリンジポンプにセットし、固定ネジで固定します。

シリンジポンプの電源を入れます。流量条件はあらかじめ設定済みです。この血液を 30 µL/min でデバイス内に流します。シリンジ本体をシリンジポンプに装着したら、可動プランジャーアームのボタンを押し、プランジャーの上端に接触してチップから液体が押し出されるまでスライドさせます。

これは鈍端のステンレス製針です。システムのプライミングが完了したことを確認し、「run」ボタンを押します。血液の流れを開始し、停止させるには「stop」ボタンを押してください。その後、清潔な1.5 mL centrifuge tube（またはファルコンチューブ）を用意し、慎重に接続を解除します。

1つだけ取り外し、デバイスの1つのポートからチューブを抜きます。チューブを抜いた後、それを1.5 mLのファルコンチューブに挿入します。そして「run」を押して、再び血液の流れを開始させます。

血液の滴が形成されたら、ポンプを停止し、デバイスに設けたインレットに挿入します。「run」を押して血液を流し、5分間のタイマーを設定します。血液がすべてのチャンバーに均等に充填され、デバイス内に明らかな気泡がないことを確認してください。

いずれかのチャンバーへの流れを妨げる気泡がある場合は、ピンセットを使用して、キャプチャチャンバーへ続く細いチャネル、またはキャプチャチャンバーから出る細いチャネルに沿って動かしてください。このデバイスは順調に充填されていますので、5分後、シリンジポンプのストップボタンを押し、血液の流れを停止させます。シリンジのクランプを緩めて、シリンジポンプのホルダーから取り出します。次に、ヌクレアーゼフリーPBSを満たしたシリンジ3を使用します。基本的に、再びデバイスの表面を濡らして気泡の混入を防ぎ、シリンジを軽く叩いて、気泡がすべてシリンジ本体の上部に集まるようにします。

シリンジポンプのアームを緩め、3 mLシリンジをポンプに挿入します。アームを締め付け、プランジャーがシリンジのプランジャーに接触するまで押し下げます。「Run」ボタンを押し、液体がデバイス内に充填され、ステンレス針の先端に液滴が現れるまで待ちます。

液滴が形成されたことが確認できたら、ポンプを停止します。血液が付着しているステンレス製チップを取り出します。次に、洗浄バッファーを挿入し、「run」を押します。

この状態で5分間流します。その際、清潔なワイプを使用して、入口または出口に付着している少量の血液を拭き取ってください。5分間洗浄バッファーをデバイスに流すと、デバイス内の血液は完全に除去されます。デバイス内に赤血球が残っておらず、透明に見えることでこれを確認できます。5分経過後、洗浄バッファーの通液を停止します。

そして再び、シリンジポンプからシリンジを取り外します。柔軟な出口チューブの先に、1.5 mLマイクロ遠心チューブのキャップをはめます。その後、マイクロ遠心チューブを慎重に持ち上げ、デバイスから廃液チューブを引き抜きます。

これはバイオハザード容器に廃棄します。キットには、テフロン製の新しい出口チューブが含まれています。こちらにも同様に、ステンレス製のチップが付いています。

古いアウトレットチューブを、この新しいアウトレットチューブに交換します。アウトレットチューブを取り出し、U字型またはV字型になるように曲げます。また、キットにはKaya shredder columnが付属しており、これによりDNAを剪断し、基本的に細胞溶解物を均質化します。

シュレッダーカラムの紫色のキャップを開け、出口チューブをK-Shredderカラムに挿入します。キットから、RLT用と記載されている2番のシリンジを取り出します。これは、22ゲージの鈍端ステンレス針を備えた標準的なBD製1 mLシリンジです。

これを使用して、Kyogen社の標準RLT 350 µLをデバイスに注入します。デバイスには約 50 µLのデッドボリュームがあるため、RLTを注入した後、その後に空気のプラグを注入して、デバイス内のデッドボリュームをchi shredderカラムへ押し出す必要があります。その手順として、シリンジでまず空気 350 µLを吸引し、次にRLT 350 µL（0.35 mL）を吸引します。これで、シリンジの底部にRLTがある状態になります。

シリンジをひっくり返して空気を注入したくなるかもしれませんが、そこは堪えてください。この空気は、RLTをすべてQIAshredカラムに送り込むために必要です。次に、洗浄バッファーからのチューブを外します。

RLTを満たしたシリンジを挿入し、約30秒かけてゆっくりとデバイス内にRLTを注入します。この際、出口チューブから廃棄物がchi shredderカラムに排出されていることを確認してください。デバイス内に空気が入り始めたら、プランジャーを押し下げ、すべての液体がKay Shredderカラムに放出されるまで待ちます。kay shredderカラムを取り出し、バランスを合わせたマイクロ遠心機を用いて、15,000 RPMまたはベンチトップマイクロ遠心機の最大回転数で2分間遠心分離します。

カラムを2分間遠心分離した後、RLT溶液中のサンプルを取り出し、付属の紫色のキャップ付きクライオバイアルに移します。臨床サンプルを使用している場合は、実験開始時にこれらのクライオバイアルにラベルを貼ってください。これがクライオバイアルに入った溶解物です。

このクライオバイアルを直ちに-80°Cのフリーザーに入れ、輸送または後日のRNA抽出まで保存します。これは好中球を単離するための代替プロトコルです。RLTバッファーで細胞を溶解させる代わりに、標準的な組織学的染色で染色を行います。

染色を行います。密封されたデバイスをバッグから取り出し、再度包装を解きます。デバイスのロット番号を記録し、シャーレをシャーレホルダーに設置します。

袋から1 mLシリンジ（シリンジ1）を取り出し、700 µLの血液を充填し、その半分である350 µLをeend DPHチューブに注入します。これをそのままにしておきます。次に、接続用チューブがついたシリンジ4を使用し、デバイスに血液を注入します。

チューブの先端にある針の根元を化学的な手法で固定します。シリンジ本体を取り外し、ルアーを満たします。アダプターを用いてバッファー処理を行い、そのシリンジを廃棄します。

化学ワイプを用いて漏出分を拭き取りながら、血液の入ったシリンジを針に装着します。シリンジを軽く叩き、針とシリンジ本体の接続部にある気泡を取り除きます。シリンジをシリンジポンプにセットし、ポンプの可動アームを押し下げてチューブ内をプライミングします。

デバイス（キャプチャデバイス）の出口の一方からチューブを取り外し、1.5 mLのエッペンドルフチューブに入れます。その後、シリンジポンプのrunボタンを押し、血液を流し始めます。ステンレス製チップの先端に血液の液滴が形成されるまで待ちます。

液滴が形成されたら、ストップボタンを押し、血液を拭き取ってからデバイスに挿入し、ランボタンを押します。ここで5分間のタイマーをセットします。デバイス内を5分間流したあと、シリンジポンプのストップボタンを押し、シリンジを取り出します。

次に、そのシリンジを、1×PBSの洗浄バッファーが入った3 mLシリンジに交換します。ここでも、デバイスの上部が密着していることを確認し、血液またはランニングバッファーが含まれているニードルチップを取り除きます。デバイスのプライミングを開始してください。

液滴を形成させた後、デバイスに挿入し、「run」を押します。入口または出口のチューブに付着した血液を拭き取り、洗浄ステップの後、5分間流します。再度、シリンジポンプを停止させ、ポンプホルダーからシリンジを取り出します。標準的なGIM染色を行うため、まず細胞を固定し、100% methanolを用いて脱水させます。

メタノールを充填した3 mLシリンジを用意します。ここでも再度シリンジをプライミングして、メタノールが流れていることを確認し、シリンジポンプを停止させてからデバイスに挿入し、「run」を押します。このメタノール溶液中で2～4分間固定します。

固定およびメタノールの処理を2～4分間行った後、ポンプを停止し、メタノールが入ったシリンジを外します。ここで、脱イオン水で1:5に希釈したSigma社製のEosin（エオシン）標準液を含む3 mLシリンジを用意します。希釈後、シリンジに充填し、デバイスの詰まりの原因となる粒子を取り除くため、シリンジの先端に0.8 µmフィルターを取り付けます。その後、5～10分間染色します。

次に、脱イオン水で洗浄します。5〜10分間の染色後、シリンジポンプを停止し、染色バッファーが入ったシリンジを脱イオン水が入ったシリンジに交換します。デバイスからSAIの青色が見えなくなるまで洗浄します。過剰なgim sustainがデバイスから洗い流されたら、洗浄液の注入を停止します。

次に、インレットから水用シリンジを取り外します。その後、デバイスのアウトレットチューブを持ち、ピンセットでチューブの端を固定します。

これは柔軟なTygonチューブであり、これをデバイスの入口に再度挿入します。これによりデバイスが密封され、細胞の水分が維持され、その形態が保持されます。ここからは、同僚のJohn Hong Chang博士が、CD4陽性リンパ球の分離、およびそれに続くマイクロ流体デバイス内での直接的な免疫蛍光染色の代替プロトコルを説明します。

私の名前はShong Hongです。本日は、マイクロ流体デバイスにおける細胞染色の方法を実演します。これまでの段階で、マイクロ流体免疫親和性分離デバイスを用いて、未処理の全血から特定の血球細胞を分離する方法をご説明しました。この目的として、分離した細胞を溶菌させ、そこからタンパク質やDNA成分を抽出したい場合があります。一方、私の研究目的では、細胞を回収して細胞数を算出することに関心があります。例えば、全血からCD4細胞数を算出し、それを診断目的の指標として利用することなどを検討しています。

使用するデバイスはKenのデバイスと非常に類似しています。これはPDMS製の直線的なチャンバーで構成されています。形状がわずかに異なるため、操作パラメータも若干異なりますが、全般的な操作手順はほぼ同様です。

そのため、細胞のキャプチャと洗浄のステップはすべて省略し、細胞計数手順における細胞染色のステップへ直接進みます。ここでは、全血からすでに半数の細胞がキャプチャされ、PBSで洗浄済みのデバイスを用意しています。これにより、不要な細胞はすでにデバイスから洗い流されています。また、デバイス内に単離された細胞を特異的に標識するために使用する抗体混合液をあらかじめ準備しています。

ここで使用した抗体濃度は、蛍光顕微鏡下で非常に高い蛍光強度で細胞を染色するために最適化されています。手順は非常に単純です。抗体溶液を満たしたシリンジをシリンジポンプに装着し、流量が必要なパラメータに正しく設定されていることを確認します。

次にシリンジポンプを開始し、チューブの末端を確認して、溶液が既に出ていることを確認し、チューブ内に気泡が残っていないようにします。その後、細胞を捕捉したマイクロ流体デバイスにチューブを接続します。これにより、デバイス内に単離した細胞を染色するために抗体がデバイス内へと流れます。ここでの流速は5 µL/minとしていますが、デバイスの形状によっては、目的に応じて異なる流量パラメータを使用する必要がある場合があります。

抗体溶液を5分間流します。これにより、マイクロ流路内のすべての溶液を置換するのに十分な量となります。抗体の注入後、フローを停止します。つまり、マイクロ流路内のすべての溶液を置換するため、抗体を5 µL/minで5分間流します。

その後、フローを停止し、デバイスを室温で30分間インキュベートします。この操作は暗所で行ってください。これは、細胞を染色抗体でインキュベートしている間に、蛍光抗体が消光するのを防ぐためです。通常15分から30分間の染色後、デバイスからチューブを取り外し、抗体シリンジをバッファーシリンジに交換して、デバイスから未結合の抗体を洗い流します。

ここでの洗浄液には、PBS溶液中の1%BSAが含まれています。BSAは表面への抗体の非特異的結合をブロックするために使用され、ここでも同様の手順を行います。まず、目的の流量になるようシリンジポンプの流量を調整し、次にシリンジポンプを始動させ、デバイスに接続する前にチューブから実際に液体が出ていることを確認します。

この操作の目的は、チューブ内に気泡が残らないようにすることです。これにより、注入時にデバイスへ気泡が入るのを防ぐことができます。次に、チューブをデバイスに接続し、さらに5分間流し続けて、デバイス内から洗浄液および未結合の抗体をすべて洗い流します。

洗浄ステップの後、1% PFAで細胞を固定します。固定を行う目的は、すぐにイメージングを行えない場合に、デバイスを数週間保存できるようにするためです。したがって、この手順は非常に単純です。

手順は以前に行ったものと同様です。シリンジをポンプに取り付け、流速を目的の値に調整します。次にシリンジポンプを始動させ、チューブをデバイスに接続して、細胞を固定するための固定液であるパラホルムアルデヒド（PFA）溶液をデバイス内に注入します。ここでも、約5分間流し続けます。

PFAがデバイス内のすべてのバッファーに置き換わることで、デバイス内のすべての細胞が固定されます。PFAによる固定ステップの後、PFAシリンジを取り外せば、デバイスはイメージング可能な状態になります。場合によっては、細胞表面マーカーの染色と重ね合わせて表示させるために、核染色を行いたいことがあります。

そのため、最後にDPIを用いて核染色を行います。DPIを充填したシリンジをセットしてシリンジポンプを起動し、デバイス内にDPIを流します。これにより、細胞の位置を示すために細胞核が染色されます。

このように、DPI染色の画像は、後で表面マーカー染色の画像と重ね合わせることで、細胞の位置を示すことができます。そのため、DPI染色の最後に、再びバッファー溶液で未結合のDPIを洗い流す必要があります。ここでは、未結合のDPIを洗浄するために、再び1%BSAを含むPBSを使用します。

操作手順は、これまでに行った方法と同様です。バッファー充填済みのシリンジをデバイスに接続し、バッファーを流して未結合のdapを洗い流します。以上が、マイクロ流体デバイス内での細胞染色の全手順です。

すべての染色手順が完了すると、デバイスはイメージング可能な状態になります。また、PFA固定を行っているため、すぐにイメージングできない場合でも、デバイスを数週間保存することが可能です。