複数の異なった株を勉強するためのマイクロ流体デバイス

本手法の全体的な目的は、同一の動的条件下で、異なる酵母株の単一細胞の挙動をイメージングすることです。これは、2層構造のマイクロ流体デバイスを作製することで達成されます。まず下層に各異なる酵母株を個別に封入し、次に上層によって動的な流れの条件を供給します。各ウェルに異なる酵母株を配置してデバイスを密閉することで、複数の分離した菌株を持つ単一のチャネルが形成されます。

次に、ダイナミックな培地変化に対する細胞応答をイメージングします。Y字型チャネルの2つの入力口の流量を制御することで、同一のダイナミックな条件下に置かれた異なる菌株の結果が得られ、ウェル間のクロスコンタミネーションも発生しないことが示されました。このマイクロ流体デバイスは、既存の他のシステムに比べていくつかの重要な利点があります。具体的には、同一のダイナミックな条件下で複数の異なる菌株のイメージングが可能です。

また重要な点として、特別な装置を必要とせず、どのようなラボでも簡単に作製することが可能です。この手法は、野生型East分離株の飢餓パスに対する反応を追跡する方法についての議論から生まれました。まず、目的のマイクロチャネルのレイアウトを、縮尺に合わせて描くか印刷してください。

次に、ガラススライドの上にスコッチテープを層状に貼り付けます。チャネルの目的の高さを得るために、レイアウト設計図を平らな面に置き、設計パターンに合わせてスライドを配置します。次に、レイアウトに従ってガラススライド上のテープを慎重に切り抜きます。ガラススライドのすべての領域からスコッチテープを取り除きます。

マイクロチャネルのレイアウトに従って、それらを定着させます。スライドを65 °Cの加熱オーブンに3分間入れます。その後、エタノールで穏やかに洗浄してください。

製造元の推奨に従って、PDMSのベース成分と硬化剤を混合します。PDMS混合液を約30 milliliters、ペトリ皿に高さ約0.5 centimetersになるように注ぎます。必要に応じて、真空状態でPDMSを脱気します。

パターン化したスコッチテープを上に向けて、ガラススライドをPDMSに浸します。PDMSを入れた後にパターンを配置することで、スライドとディッシュの底の間に気泡が形成されるのを防ぐことができます。新しい90 millimeterのペトリ皿に3 millilitersのPDMS混合液を注ぎ、気泡レベルを用いてディッシュが水平であることを確認し、65 °Cで48時間硬化させます。

この手順は、スピンコーターが利用可能な場合はそれを用いて行うことができます。DGAsおよびキュアは前述の通りに行います。次に、バイオプシーパンチャーを用いて、マイクロ流体デバイスのフロー層を目的のサイズに慎重に切り出します。

フロー層に、入口と出口のための穴を開けます。また、2枚目のペトリ皿から同様のサイズのウェル層を切り出し、厚いガラス上に配置します。その上に設計レイアウトをスライドさせて重ねます。

次に、レイアウトのマイクロチャネルに合わせてエタノールを用いてウェルをパンチアウトし、両方のPDMS層とガラスカバースリップを洗浄して風乾させます。続いて、不可逆的な接合には標準的なプラズマエッチャーを、可逆的な接合にはハンドヘルドコロナ処理装置を用いて、ガラスカバースリップとウェル層のPDMSを処理します。密着させるため、ウェル層をカバースリップの上に慎重に配置します。

気泡を優しく押し出します。適切なシリンジに必要な培地を準備し、シリンジポンプに通したタイゴンチューブに接続します。細胞イメージングに使用します。

ストレッチャーを使用します。目的の相に移動し、培養物を十分にボルテックスし、300 µLをマイクロ遠心チューブに分注します。PDMSウェル層の各ウェルに、con canna Aを1 µLずつ静かに滴下します。

Con Aが乾燥している間に、水を穏やかにピペッティングし、各ウェルから過剰なCon Aを2回洗い流します。グルコースを含まないSC培地 300 µLで、菌株を2回洗浄します。細胞壁から残留グルコースを洗浄することで、コンバルへの適切な接着を助けます。

ボルテックス処理後、細胞懸濁液約0.5 µLを各ウェルに丁寧にピペットで分注します。残った細胞を富栄養培地で緩やかに洗い流します。細胞の乾燥を防ぐため、次の2つのステップは迅速に行う必要があります。

オプションの手順として、ウェルに直接当たらないよう注意しながら、チップとウェルをプラズマ処理します。次に、実体顕微鏡下で、両者のアライメントに細心の注意を払いながら、チップをウェル上に慎重に配置します。軽く押して、2層のPDMSを密着させます。

約50 µLのリッチ培地をデバイスにゆっくりと完全に満たし、チャネル内に気泡が残っていないことを確認します。次に、チューブを適切なインレットに挿入してデバイスを接続し、培地のフローを開始させます。チューブ内に気泡が発生しないように注意してください。気泡がデバイス内で停滞し、フローを妨げる可能性があります。

デバイスを顕微鏡下に設置し、各ウェルで適切なイメージングポイントを探します。細胞を回復させるため、十分な量の培地を1時間、あるいは必要に応じてそれ以上の時間、流し続けます。

一定流速の設定で実験を開始します。ポンプAを0.8 milliliters per hourに、ポンプBを0.2 milliliters per hourに設定してください。培地がチャネル幅の80%以上にわたって流れていることを確認します。

相対的な流量を変化させることで、デバイス内の条件を動的に変更することが可能です。新しい条件は、数秒以内にチャネル全体で安定します。異なる菌株間の分離を実証するため、識別可能な2種類の酵母菌株を交互のウェル内でイメージングします。

この実験では、ウェル間で細胞の漏出がないことに注意してください。動的に変化する条件の同時効果を検証するため、両方の菌株において転写因子MSN2にYFPをタグ付けしています。2つの入力チャネルの流量を変更し、グルコース不含培地のステップを作成しました。

これにより、MSN twoが核に局在しました。重要な点として、単一細胞における核内MSN two YFPレベルのタイムコースを解析することが可能です。したがって、このPDMSマイクロ流体デバイスを用いることで、複数のウェルに対して同時に動的な条件を適用することができます。

この手順を行う際は、デバイスの組み立て中に細胞を乾燥させないよう注意することが重要です。この手法を習得すれば、ソフトリソグラフィーを用いる必要なく簡単に実施することができます。