クローン原性アッセイ：付着細胞

こんにちは、Lumです。私は現在、エピゲノミック医学研究室の主任であるTom Carianne博士の指導のもと、BE IDI心臓・糖尿病研究所で博士課程の研究に取り組んでいます。このビデオでは、「クローノジェニック生存アッセイ（Clon Genic Survival Assay）」として知られる手法を実演します。これは50年前からある手法で、放射線照射や化学剤への曝露など、さまざまな処置が細胞の生殖能に与える影響を評価することができます。

同系生存率アッセイ（Congenic survival assay）は、異なる細胞株の放射線感受性を評価し、さまざまな放射線防護剤または放射線増感剤の有効性を試験するための放射線生物学における中心的な手法です。付着性細胞株を用いる場合、この生存率アッセイは3つの段階で構成されます。まず、付着細胞の単層を処理します。

第二に、単一細胞懸濁液の調製と、既知数の細胞の播種およびディッシュへの塗布を行い、第三に、一定期間のインキュベーション後に形成されたコロニーの染色とカウントを行います。このビデオでは、不死化ヒトなどの細胞を使用し、天然抗酸化剤の放射線保護特性を決定するために、コロニー形成アッセイをどのように利用できるかを示します。実験当日に1フラスコあたり100万個の細胞が存在するように、あらかじめT25フラスコに5 mLの培地とともに細胞を播種しておきます。

適切にラベル付けした各フラスコ内の5 mLの培地に、必要濃度にするため、異なる濃度の薬剤を50 µLずつ添加します。今回は5つの濃度と、コントロールとしてPBS（溶媒コントロール）を使用します。薬剤添加後、使用した細胞株に適した条件下で1時間インキュベートします。インキュベート後、コントロール群を除く各群に、セシウム線源から放出されるガンマ線を用いて、本実験で設定した4 Gyの線量で照射します。

照射後、培地を捨て、各フラスコを2 mLのPBSで5分間洗浄します。PBSを捨てた後、0.05%トリプシンを各フラスコに2 mL加え、付着した細胞をフラスコから剥離させます。その後、トリプシンを不活性化させるため、10%胎児牛血清を含むDMEM 5 mLを各フラスコに加えます。

その後、ファスキュラの全内容物をラベル付きの10 milliliterファルコンチューブに移します。完了後、これらのチューブを5分間遠心分離し、ペレットを乱さないように注意して上清を廃棄し、各チューブに5 milliliterのcrecy培地を加えます。各サンプルの細胞濃度を算出し、各サンプルを5 milliliterの培地と共に5枚のペトリ皿に播種するために必要な細胞数となるよう、各サンプルの必要量を算出します。

例えば、コントロール群では1皿あたり100個の細胞を播種するため、25 mLあたり500個の細胞にするために必要な容量を算出します。より濃度の高いサンプルについては、100 µL未満の容量を使用する際の誤差を最小限に抑えるため、10倍希釈または100倍の段階希釈を行います。次に、各サンプルについて、あらかじめ計算した容量を25 mLの培地が入ったファルコンチューブに分注して調製します。これで、あらかじめラベルを貼ったプレートにサンプルを移し替えることができ、取り扱いと運搬を容易にするため、各皿に5 mLずつ添加します。

ディッシュを、大型の滅菌済みまたは消毒済みの容器に保管します。次に、ディッシュを適切な条件に設定した加湿インキュベーターに入れ、8日間培養します。8日後にケラチノサイトを使用する場合は、インキュベーターから注意深くディッシュを取り出し、ドラフトチャンバー内で1枚ずつ並べて配置します。

形成されたコロニーが乱れないよう、プレートを慎重に扱ってください。蓋を取り外し、洗浄のために各ディッシュに0.9%生理食塩水を5 mL加えます。ピペットチップをディッシュの隅に向け、コロニーを誤って掻き出さないよう、ディッシュの底に触れないようにしてください。

5分後、生理食塩水を慎重に吸引して取り除きます。次に、3 mLの4%固定液でコロニーを固定し、蒸発を防ぐために蓋を閉め直します。15分から30分後、固定液を吸引して適切に廃棄します。

コロニーを0.1% Crystal violetで染色します。各ディッシュに5 mLずつ加え、30分から1時間後に蓋を戻します。その後、蒸留水で染料を洗い流し、ディッシュを逆さまにして一晩乾燥させます。これで、コロニーをカウントする準備が整いました。

コロニーは解剖顕微鏡を用いて手動でカウントできます。50個以上の細胞を含む細胞クラスターはすべてコロニーとみなされます。以上で、Congenic生存アッセイのデモンストレーションを終了します。

本アッセイの他の手法に対する主な利点は、極めて感度が高く、6 logの細胞死後であっても広範囲にわたって生存率を検出できる点にあります。この感度は、より多くの細胞数を播種することで実現されています。本アッセイは、細胞毒性試験などの他の目的にも容易に利用可能です。

ご視聴ありがとうございました。