ランダムコニカルチルト方式を使用したエキソソーム複合体の単粒子の電子顕微鏡再構成

本実験の全体的な目的は、ランダムコニカルチルト法を用いてエキソソーム複合体の三次元構造を得ることです。まず、タンパク質複合体の支持基材とするために、ホーリーカーボン gridsにカーボンフィルムの薄層を堆積させ、次に染色剤を塗布します。その後、試料と染色剤をグリッド上に適用し、試料を重金属塩で包み込みます。

次に電子顕微鏡を用いて、試料の傾斜ペアマイクログラフを撮影します。最終的に、ランダムコニカルティルト法を用いた画像解析に基づき、エクソソーム複合体の三次元構造を示す結果が得られます。一般的に、この手法に不慣れな方は、ランダムコニカルティルト法のための適切な試料調製や、その後の画像処理の手順に苦労することがあります。

試料評価の図解なしにグレーディングおよび試料作製ステップを習得することは困難であるため、本手法の実演は極めて重要です。ランダム円錐傾斜法の原理では、電子顕微鏡内で試料の同一領域から一対の顕微鏡写真を撮影する必要があります。一方の写真は試料を傾斜させない状態で撮影し、もう一方は試料を50度から70度の角度で傾斜させて撮影します。コンピュータを用いて、デジタル化された一対の顕微鏡写真を並べて配置し、本実演では同一粒子の画像を選択します。

これらの画像には、3次元座標で番号が付与されています。傾斜させていない粒子の画像と、それに対応する傾斜させた粒子の画像は、傾斜軸の方向と傾斜角によって互いに相関しています。傾斜させていない粒子の画像をアライメントすることで、傾斜させた粒子の画像がそれぞれ対応するasMuleの位置へと導かれます。方位角空間を埋める傾斜粒子の複数の画像を用いることで、逆投影アルゴリズムを使用して分子の3次元構造を再構成できます。グリッドを作成するには、まず、100 mLのガラスビーカーに0.45 gのポリビニルホルマル樹脂と90 mLのクロロフォームを加え、0.5%のform VAR溶液を調製します。

ドラフトチャンバー内で、ビーカーをアルミホイルで覆い、form var樹脂を溶解させます。小型の撹拌子とマグネチックスターラーを使用すると、樹脂の溶解に約15分かかります。その間に、あらかじめ洗浄済みの顕微鏡用ガラススライドをメタノールとキムワイプで清掃します。

クロロホルム中でフォームバ resin が完全に溶解した後、50% glycerol 1 mL を溶液の表面に加えます。添加する glycerol の量を調整することで、ホーリーカーボンの孔密度を制御できます。

超音波ホモジナイザーのチップを溶液に浸します。深さ約1インチの位置で最大出力を使い、1分間ソニケーションを行います。これにより、溶液中にグリセロール液滴のエマルションが形成されます。ソニケーション時間を長くすると、ホーリーカーボンの孔径がより小さくなります。

このステップの後、溶液は乳白色になります。超音波洗浄直後に、清潔なガラススライドをエマルションに垂直に浸します。1秒後にスライドを取り出し、フィルターペーパーでスライドの底面を吸い取り、スライド表面に薄いプラスチックフィルムを形成させます。

クロロホルムが蒸発した後、光学顕微鏡でフィルムの孔の密度とサイズを確認します。ここで述べている作製条件では、400メッシュのグリッドの各正方形に、直径3〜4 µmの孔が10〜20個形成されるはずです。ガラススライドが乾燥したら、スライド表面にあるプラスチックフィルムの端を切り取ります。

スライドを水中に垂直に浸し、蒸留水の表面にフィルムを浮かせてください。水面上の薄膜は、光の反射に対して浅い角度から観察することができます。400メッシュの銅グリッドの平滑面を下に向けて、フィルムの上に1枚ずつ配置してください。

紙片を用いて、格子付きのプラスチックフィルムを拾い上げます。紙を裏返しにして乾燥させます。ペトリ皿の中で、紙をメタノールに浸して穴の中の残留グリセロールを除去し、その後、風乾させます。

カーボンエバポレーターを用いて、グリッドに約20 nanometersの厚さのカーボン層をコーティングします。蒸着時間を調整して、目的の厚さを制御してください。厚さは、既知の厚さのカーボン層の灰色と、コーティングされたカーボンの灰色を比較することで判断できます。

カーボン支持膜付きグリッドを、ガラス製ペトリ皿に入れたクロロホルムに30分間浸してフォームバーを除去します。その後、グリッドを乾燥させることで、自家製のホーリーカーボングリッドが作製されます。次に、切り出したばかりのマイカ表面に、厚さ約5 nmの薄いカーボン層を蒸着させます。その後、蒸留水の下で、ホーリーカーボングリッドをフィルターペーパー上に慎重に配置します。

自作の装置を用いて、マイカ表面から薄いカーボンを水面に浮かべ、それをホーリーカーボングリッド上にゆっくりと転写させます。グリッドが載ったフィルターペーパーを回収し、乾燥させます。ドラフト内で、新しく調製した2%ギ酸ウラニル溶液を用いて、エクソソーム複合体のネガティブ染色を開始します。

記載の手順に従い、溶液チューブをアルミホイルで覆います。光への曝露を防ぐため、溶液は同日に使用してください。グロー放電装置を用いて、カーボングリッド全体に薄いカーボン層をグロー放電処理します。次に、ベンチ上に清潔なパラフィルムを置き、パラフィルムの上に尿酸ホルム酸染色溶液を50 µLずつ3滴滴下します。希釈バッファーを用いて、エクソソーム複合体を約50 nMの濃度に希釈します。希釈したタンパク質4 µLを、グロー放電処理したグリッド上にピペットで滴下します。

サンプルをグリッド上に1分間静置し、次にピンセットでフィルターペーパーを用いて余分な溶液を吸い取ります。すぐにグリッドをひっくり返し、1滴目の染色液の上に置き、グリッドを数回前後に動かして約10秒間すすぎます。最後のすすぎの後、3つの染色液それぞれの滴についてこの工程を繰り返し、染色液をさらに1分間グリッド上に静置させます。

次に、フィルターペーパーで染料を吸い取ります。グリッド表面に薄い染料溶液の層を残したまま、ドラフトチャンバー内でグリッドを乾燥させます。サンプルグリッドをサンプルホルダーにセットし、そのホルダーをFEI TE nine 12電子顕微鏡に挿入します。

低倍率でサンプルグリッドを確認し、染色状態の良いスクエアを探します。良好なスクエアでは、大きさ約1〜2 µmの穴が12個ほどあり、その内部に暗い染色領域が見られます。FEIユーザーインターフェースの低線量モード（low dose mode）をオンにし、低線量モードでサーチフォーカスと露光位置を調整します。

サーチモードをフラクションモードに設定し、カメラ長を1.5 meterに設定します。フォーカスを150 K倍に設定し、露光を50 K倍、露光時間を1秒に設定します。通常、サーチモードと露光モードの両方でグリッド上の認識可能な特徴点を用いてアライメントを行います。

サーチモードで染色の良好な孔を探索し、その位置を保存します。正方形のCCD写真を撮影します。試料を55度に傾け、もう一度写真を撮影します。

2枚の写真を比較し、2つの顕微鏡写真における対応する孔を特定します。ステージを傾斜させ、0度に的に戻します。低線量キットを使用して、探索モードで特定した各孔を、デフォーカス約-0.7 µmの高倍率で撮影します。

すべての孔の写真を撮影した後、同じ倍率のままステージを55度に傾けます。デフォーカスを約-1.2 µmに設定し、傾斜させた試料の顕微鏡写真を撮影してください。自作のホーリーカーボングリッドの不規則なパターンを用いて、低倍率の顕微鏡写真のパターンに基づき、対応する傾斜ペアの顕微鏡写真を特定します。

相関を促進するため、粒子が均一に分散しており、粒子の周囲にハロー（光輪）がないマイクログラフの傾斜ペアを選択してください。粒子の周囲に明らかなステインハローが見られるマイクログラフは、データ処理から除外する必要があります。まず、手順の中のプログラムセットアップから開始してください。

画像処理は、Emanパッケージのprocess 2Dを用いて実演します。画像フォーマットを変更するには、2Dアライメントを行うためのiMagic fiveパッケージとspiderパッケージを使用します。3D再構成およびリファインメントを行うには、GatanのDM3デジタル画像をspider画像フォーマットに変換してください。

process 2Dコマンドを使用して、粒子ペアを選択します。spiderプログラムパッケージに付属しているウェブプログラムを使用すると、プログラムが自動的に粒子の座標を保存し、spiderスクリプトを用いて選択したすべての粒子をボックスアウト（切り出し）します。このスクリプトにより、傾斜および非傾斜の粒子スタックが保存されます。

UN傾斜粒子をIMAG fiveフォーマットに変換します。EM two EMプログラムのバンドパスを用い、IMAG fiveのInCorp prepコマンドでUN傾斜粒子をフィルタリングおよびマスキングし、centerコマンドを用いてバンドパスマスクされた粒子の中心合わせを行います。IMAG fiveにおいて、IMAG fiveプログラムを自動的に実行するバッチスクリプトを用い、粒子を反復的に均質なクラスへとアライメントおよび分類します。

次に、IMAG fiveのclassコマンドでMSA名を用いて粒子のクラスルックアップテーブルを作成し、headerコマンドを用いて各粒子のアライメントにおける並進および回転値のプロットファイルを生成します。iMagic fiveにおいて、EM two EMプログラムを使用してアライメント済みの粒子をspider形式に変換します。その後、クラスルックアップテーブルをspiderドキュメントファイルに変更します。

各粒子の整列における平行移動および回転の値もSpiderドキュメントファイルに変換します。IMAG5で行った非傾斜粒子と同様に、傾斜粒子のバンドパスフィルタリング、マスク処理、および中心合わせを行い、中心合わせ済み傾斜粒子の新しいデータセットを生成します。IMAG5で生成されたマルチリファレンス整列ドキュメントと、ウェブプログラムによって生成されたDCBファイルから、角度ドキュメントファイルを作成します。Spiderの逆投影スクリプトを使用して、各クラス平均に対する初期モデルを1つずつ取得します。

最後に、spiderスクリプトを用いて、すべての非傾斜粒子に対して初期ボリュームの投影リファインメントを行い、RCTを用いて最終ボリュームを取得します。エキソソームの再構成が約50回得られました。これらのボリュームは、50個の非傾斜粒子のクラスにある各粒子に対応する傾斜粒子から生成されています。

spiderパッケージで実装された逆投影法を用いて、投影マッチングによる精緻化を行いました。これらのボリュームを初期モデルとして使用し、約18 Åの分解能でエキソソームの3Dボリュームを生成したことで、複合物内の異なる部位の原子モデルを3Dマップに組み込むことが可能になります。このビデオを視聴することで、標本の良好なナラティブ・スタンディング・グリッドの作成から、連続的なマイクログラフの撮影、そして最終的に画像解析手法を用いて3次元再構成を得るまで、RCTを用いて3次元再構成を行う方法を十分に理解できるはずです。ここで説明したプロトコルの他に、画像解析において最終的な再構成を得るための手法はいくつか存在します。

信頼性の高い正確な再構築を行うために最も重要なステップは、十分に調整された試料を用いることです。