サンプル準備および透過電子顕微鏡によるエクソソームのイメージ投射

この手順の全体的な目標は、精製された細胞外小胞の形態を観察し、電子顕微鏡を使用して細胞外小胞内で特定のタンパク質局在化を行うことです。この方法は、エクソソームとその内部に位置する特定のタンパク質の分類など、細胞外小胞研究期間における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、エキソソームの内側と外側の両方に位置する特定のタンパク質の部分を観察するために使用できることです。

この技術の意味するところは、癌や細菌感染症を含むいくつかの病気の診断を確実にすることです。この方法はエクソソームに関する洞察を提供しますが、他の生物学的サンプル、マイクロセルラーインキュベーション、および特定のタンパク質局在にも適用できます。一般に、この方法に不慣れな個人は、免疫金粒子の非特異的結合中に汚染を引き起こすため、苦労します。

標準的な技術を使用して、培養中のエクソソームを調製します。次に、HCT116細胞の培養上清を超遠心分離し、培地からエキソソームをペレット化します。ペレット状にしたら、培養上清を慎重に取り除きます。

精製したエキソソームペレットを固定するには、PH 7.0の0.1モルのソルジウムカコジル酸溶液に2.5%グルタルアルデヒドの1ミリリットルを追加します。.脂質バイレイヤー小胞を摂氏4度で1時間インキュベートします。次に、固定剤を取り出し、ペレットを0.1モルのカコジル酸ナトリウム緩衝液1ミリリットルで室温で10分間すすぎます。

次に、サンプルを1ミリリットルの2%四酸化オスミウムで摂氏4度で1時間後置します。固定液を取り出し、エキソソームペレットを0.1モルのカコジル酸ナトリウム緩衝液で3回すすぎ、10分ごとに緩衝液を交換します。次に、サンプルを10分間、一連の段階的なアセトン濃度で振とうして脱水します。

次に、アセトン3部と低粘度包埋混合物1部の溶液を混ぜ合わせます。アセトンをこの混合物と交換し、サンプルを30分間インキュベートします。低粘度の包埋培地の比率を増やし続け、各ステップで30分間インキュベートします。

最後に、エキソソームペレットを低粘度包埋混合物の100%に室温で一晩インキュベートします。翌日、埋込み型を用いて純粋な低粘度包埋混合物に試料を埋め込み、65°Cで24時間焼きます。ウルトラミクロトームを使用して、厚さ60ナノメートルの切片を調製します。

切片をニッケルグリッドに置き、それらの一部を2%酢酸ウラニルで20分間二重染色し、続いてクエン酸鉛で10分間二重染色します。次に、染色した切片を透過型電子顕微鏡にセットし、80キロボルトで試料を観察し、露光時間を自動的に設定します。エキソソーム画像を表示した状態で、顕微鏡ソフトウェアを使用して画像を取得して保存します。

まず、厚さ60ナノメートルの未染色切片を含むグリッドを、0.02モルグリシンの50マイクロリットル滴に10分間インキュベートして、遊離アルデヒド基をクエンチします。次に、切片を100マイクロリットルの蒸留水でそれぞれ10分間3回すすぎます。最後のすすぎ後、切片を1%BSAを含むPBSで室温で1時間インキュベートします。

次に、50〜100マイクロリットルの抗KRS抗体にグリッドを1時間インキュベートします。次に、0.1%BSAを含むPBSの滴でグリッドを5回、それぞれ10分間洗浄します。次に、グリッドを適切な二次抗体の滴下に移し、切片を室温で1時間インキュベートします。

次に、グリッドを10分間5回洗浄し、それぞれに0.1%BSAを含むPBSを別々に滴下します。暗所で2%酢酸ウラニルで切片を20分間二重染色し、続いてクエン酸レイノルズ鉛を10分間染色します。染色した切片を透過型電子顕微鏡に置き、80キロボルトでサンプルを観察し、前述したように画像化します。

ネガティブ染色を行うためには、単離後に精製したエクソソームを2%パラホルムアルデヒド1ミリリットルで5分間固定します。薄い、フォームバー/カーボンフィルムコーティングされた200メッシュの銅EMグリッドを1分間グロー放電で処理し、次に5〜7マイクロリットルのエキソソーム懸濁液をグリッドにロードし、1分間インキュベートします。エクソソームの濃度が高すぎる場合は、濃度を適切なレベルに希釈してください。

すぐに、EMグリッドの表面にろ過した1%酢酸ウラニル溶液を約20滴垂らしてエキソソームを染色します。グリッドの端を濾紙で接触させて、余分な酢酸ウラニル溶液をグリッドから取り除き、次にグリッドを水滴ですばやくすすぎます。ピンセットを使用してグリッドをテーブルに置き、グリッドを部分的に培養皿で覆います。

グリッドを室温で10分間乾燥させてから、グリッドを画像化するか、将来の観察のために電子顕微鏡グリッドボックスに保管します。まず、薄いフォームバー/カーボンフィルムコーティングされた200メッシュの銅EMグリッドを30秒間グロー放電で処理します。次に、2%パラホルムアルデヒド溶液に固定したエクソソームを5〜7マイクロリットルのグリッドにロードし、そこで5分間インキュベートします。

次に、エクソソームを100マイクロリットルのPBSで、それぞれ3回、10分間すすぎます。エキソソーム含有グリッドを50マイクロリットルの0.5モルグリシン溶液で10分間処理し、遊離アルデヒド基をクエンチします。次に、グリッドを1%BSAを含むPBSの滴に移し、30分間ブロックします。

次に、50〜100マイクロリットルの抗PD-L1抗体を使用してグリッドを室温で1時間、または摂氏4度で一晩インキュベートします。0.1%BSAを含むPBSを5滴ずつ10分間グリッドを洗浄し、その後、グリッドを二次抗体の滴に移し、1時間待ちます。次に、0.1%BSAを含むPBSを5滴ずつ10分間グリッドを洗浄し、次に2滴の蒸留水でグリッドを洗浄します。

終了したら、前に示すように2%酢酸ウラニルでネガティブ染色を行い、サンプルを画像化するか、将来の観察のためにEMグリッドボックスに保存してください。ここで観察されるエキソソームの形態は、ネガティブ染色の産物です。これらのエクソソームは、乾燥プロセス中に発生する可能性のあるアーティファクトである典型的なカップ形状の形態を示します。

ホールマウントイムノゴールド染色法を用いて、エキソソーム中の特定のタンパク質の位置などの追加情報を得ることができます。ここで、白い矢印はPD-L1の位置を示しています。切片化された画像では、小胞はエクソソームの構造的特徴として知られる内腔構造を示しました。

これらも、エキソソーム全体の特定のタンパク質を識別するために免疫金染色することができます。習得すると、イムノゴールド染色技術は、適切に実施されれば、簡単な調製と切片化の後に線維性細胞で行うことができます。この手順に続いて、二重免疫染色などの他の方法を実行して、2つの異なるタンパク質の位置を同時に特定することができます。

各開発の後、この技術は、生検における疾患診断を探求するために、細胞外小胞の分野で使用される場合があります。このビデオを見れば、エクソソーム内の特定のタンパク質局在を特定する方法についてよく理解できるはずです。彼らがクロルハイド、パラホルムアルデヒド、四酸化オスミウムなどの固定液を使用していることは非常に危険である可能性があり、この手順を実行するときは、換気されたヒュームフードやラテックス手袋などの予防措置を常に講じる必要があることを忘れないでください。