iCLIP - トランスクリプトーム全体の個々のヌクレオチド分解能タンパク質- RNA相互作用のマッピング

本実験の全体的な目的は、単一ヌクレオチド解像度で、RNA結合タンパク質の結合部位のトランスクリプトームワイドなマップを取得することです。これは、第2ステップとして、生細胞にUV照射を行い、in vivoでタンパク質とRNAを共有結合的にクロスリンクさせることで達成されます。その後、クロスリンクされたRNA断片を回収するために、厳格な条件下でRNA結合タンパク質を免疫精製します。

次に、逆転写によってcDNAを合成します。これらのcDNAは、付着したペプチド部分でしばしば切断されるため、RNA内のクロスリンク位置に関する情報が保持されます。cDNAライブラリーの高スループットシーケンシングに基づき、トランスクリプトーム内のすべての結合部位を示す結果が得られます。この手法は、異なるRNA結合タンパク質の相互作用がどのようにRNAプロセシングを制御しているかなど、RNA生物学における重要な疑問を解決するのに役立ちます。本手法の主な利点は、タンパク質とRNAの相互作用に関するトランスクリプトームワイドなマップの性能と解像度の両方を向上させられることです。それでは、培養細胞のUVクロスリンクの手順を開始します。

10 cmプレートで培養したhealer細胞から培地を除去します。氷冷したPBSを6 mL加え、プレートを氷上に置きます。1枚のプレートで3回の実験が可能です。

蓋を取り外し、細胞を照射します。254 nanometers、150 millijoules per centimeter squaredで一度照射した後、セルリフターを用いてプレートから細胞を掻き取り、回収します。細胞懸濁液を2 mLずつ3本のマイクロチューブに分注し、細胞をペレット化します。4 °Cで最高速度にて10秒間遠心分離します。

次に、上清を抜き、細胞ペレットをドライアイスで凍結させ、使用時まで−80°Cで保存します。新しいマイクロチューブに、実験あたり100 µLのプロテインA Dynabeadsを加えます。マウスまたはヤギ抗体を使用する場合は、プロテインG Dynabeadsを使用してください。

ビーズをライシスバッファー（詳細は付属の書面プロトコルを参照）で2回洗浄します。2〜10 µgの抗体を含む100 µLのライシスバッファーにビーズを再懸濁します。チューブを室温で30〜60分間回転させます。

その後、ビーズを900 µLの溶解バッファーで3回洗浄し、次の工程に進むまで最後の洗浄液の中に保持します。免疫沈降用に、氷上のThor細胞ペレットを1 mLの溶解バッファーで再懸濁し、1.5 mLマイクロチューブに移します。

RNase Aを1:500に希釈して調製します。次に、この希釈液10 µLとTurbo DNase 2 µLを細胞溶解液に加えます。サンプルを37 °Cで正確に3分間、1,100 rpmで振盪しながらインキュベートし、直ちに氷上に移します。

次に、4 °C、22,000 ×gで20分間遠心分離してライセートを清澄化し、ペレットとともに約50 µLのライセートを残して上清を慎重に回収します。洗浄バッファーを除去し、調製した細胞ライセートを加えます。サンプルを4 °Cで2時間回転混和します。

SUP剤を廃棄し、付属の書面プロトコルに記載されている高塩濃度バッファー 900 µLでビーズを2回洗浄します。最後に、洗浄バッファー 900 µLでビーズを2回洗浄してください。その後、RNAの3'末端を脱リン酸化し、リンカーを付加します。

プレキシガラスのシールド内で、RNAの5'末端を標識します。リンカーライゲーション反応の最後の洗浄後の上清を除去し、ビーズを8 µLのホットPNKミックスに再懸濁します。37 °Cで5分間インキュベートします。

加熱したPNKミックスを除去し、再利用します。ビーズを1×サンプルローディングバッファー 20 µLに懸濁させます。その後、サーモミキサーを用いてサンプルを70 °Cで10分間インキュベートします。

直ちにサンプルをマグネットに載せ、空のビーズを沈殿させます。メーカーの指示に従い、4～12%の新規ページ。Bissゲルにサンプルをロードします。

また、プレステイン済みタンパク質サイズマーカーを5 µLロードします。ゲルを180 Vで50分間泳動します。製造元の指示に従い、NOVA wet transfer apparatusを用いて、ゲルからニトロセルロース膜へタンパク質RNA複合体を転写します。

転写後、メンブレンをPBSバッファーで洗浄します。次に、サランラップで包み、-80 °Cでフィルムに露光させます。露光時間は30分、1時間、および一晩として行います。

次に、低分子RNAからのタンパク質RNA複合体に基づき、メンブレン領域を切り出します。オートラジオグラムをマスクとして使用し、実験を行ってください。プロテアーゼK消化およびフェノール・クロロホルム抽出により、メンブレンからRNAを回収します。

AYPプライマーのいずれかを用いてRNAを逆転写し、cDNAをゲル精製します。6 µLのcDNAサンプルを、6 µLの2倍TBE尿素ローディングバッファーと混合します。これは、サンプルをゲルにロードする直前に行ってください。

サンプルを80 °Cで3分間加熱します。次に、低分子量マーカーとともに、サンプルをプリキャスト6% TBE ureaゲルにロードします。メーカーの指示に従い、180 Vで40分間電気泳動を行い、上部の色素およびプラスチック製ゲルサポートの目印を目安にして切り出しを行います。

120～200ヌクレオチド、85～120ヌクレオチド、および70～85ヌクレオチドの3つのバンドを切り出します。arc lipプライマーとL3配列を合わせて、clip配列の52ヌクレオチド分となることに注意してください。400 µLのTE bufferを加え、ゲルのスライスを小さく砕きます。

1 mLシリンジのプランジャーを用いて、ゲル片を1,100 rpmで2時間、37 °Cで振盪インキュベートします。2枚の1 cmガラスプレフィルターをCoStar spinxカラムにセットします。サンプルの液相部分をカラムに移し、13,000 rpmで1分間遠心分離し、1.5 mLチューブに回収します。

0.5 µLのglyco blueと40 µLの酢酸ナトリウム（pH 5.5）を添加します。その後、サンプルを混合します。1 mLの100%エタノールを添加します。

再度混合し、−20 °Cで一晩静置してサンプルを沈殿させます。最後に、CD NA分子を環状化し、5'末端にアダプター領域を結合させます。次に、アイクリップライブラリーのシーケンシングに先立ち、付属の書面プロトコルに従って再線状化およびPCR増幅を行います。実験の成否は2つのステップで確認できます。

メンブレン転写後のタンパク質-RNA複合体のオートラジオグラフおよびPCR産物のゲル画像において、RNA含有量の少ない試料では、タンパク質の分子量よりも高い位置に拡散した放射能が観察されるはずです。RNA含有量の多い試料では、この放射能はタンパク質の分子量により近い位置に集中します。免疫沈降に抗体を用いない場合、シグナルは検出されないはずです。

免疫沈降の特異性を確認するためのさらなる重要なコントロールとして、UV照射を省略するか、あるいは目的のタンパク質を発現していない細胞を使用します。PCR産物のゲル画像では、CD NA画分に相当するサイズ範囲が示されるはずです。なお、PCRプライマーのP three CelexaおよびP five Celexaにより、CD NAのサイズに76ヌクレオチドが追加されることに注意してください。免疫沈降時に抗体を使用しなかった場合、対応するPCR産物は検出されないはずです。

この手順を行う際は、64のステップのすべてが重要であり、100%の正確さで実施されなければならないことに留意してください。ICLデータは、トランスクリプトーム全体の機能解析と計算的に統合することが可能です。これにより、例えば、RNAプロセシングの位置依存的な制御に関する知見を得ることができます。

計算データ解析については、欧州バイオインフォマティクス研究所のNicholas KA氏およびリアナ大学のbla zupan氏との共同研究による最近の出版物を参照してください。それでは、あなた自身の実験を始めてください。お楽しみください。