植物のプロトプラストからのmRNAインターアクチベント捕獲

この最適化されたmRNAインタラクトームキャプチャーの全般的目的は、植物細胞からmRNA結合プロテオームを単離し、同定することです。本手法は、様々な細胞アッセイにおいて汎用的なツールとして用いられる細胞型であるシロイヌナズナ（arabidopsis thaliana）の葉肉細胞プロトプラストに適用されます。この手法は、植物のメッセンジャーRNA結合タンパク質の発見やその役割の解明など、転写後遺伝子調節の分野における重要な問いに答えるのに役立ちます。

この手法の主な利点は、生理的環境から直接、結合プロテオーム上の植物メッセンジャーを単離および同定できることです。したがって、この方法は Arabidopsis の葉肉細胞プロトプラストから、メッセンジャーRNA結合タンパク質に関する知見を提供することができます。また、他の植物のプロトプラストや組織など、他の系にも適用可能です。

この手法のアイデアは、酵母および哺乳類細胞株への適用が成功していることに気づいたときに得られました。テキストプロトコルに従い、2つの異なるサンプルについてシロイヌナズナの葉肉細胞プロトプラストを単離します。UV架橋を行わないコントロールサンプル（非架橋サンプル）は氷上で保持してください。

架橋を行うプロトプラスト懸濁液（CLサンプル）を大きなペトリ皿に移します。皿に氷冷したMMG溶液を30 milliliters加え、表面を覆い、緩やかなピペッティングで細胞を分散させます。UV架橋装置へ運ぶ際は、ペトリ皿をアルミホイルで覆ってください。

開いたペトリ皿を直ちにUVクロスリンク装置に設置します。皿とUVランプの距離が8 cmであることを確認し、サンプルに1分間照射します。その後、ペトリ皿からプロトプラスト懸濁液を速やかに2本の新しい50 mLラウンドボトムチューブに分注します。

ディッシュの底部を氷冷したMMG溶液5 mLでさらに洗浄し、残りのプロトプラストを回収します。懸濁液を2本のチューブに等分します。次に、non-CLおよび2本のCLサンプルチューブを、4 °C、100 ×gで5分間遠心分離します。

上清を廃棄した後、non-CLペレットが入ったチューブを再び氷上に置きます。各CLサンプルチューブに氷冷したMMG溶液を10 milliliters加え、チューブを静かに振ってペレットを再懸濁させます。2つのサンプルを1つの50 milliliterラウンドボトムチューブに合わせた後、4 degrees celsiusで100 times gにて5分間遠心分離します。

上清を捨てた後、ペレットを氷上に保持します。次に、各サンプルの細胞ペレットに、氷冷した溶解結合バッファーを9 mL加えます。ピペッティングで約20回吸い上げと吐き出しを繰り返し、溶液が均一な薄緑色になるまでプロトプラストを溶解させます。

均質化のため、プロトプラスト溶解液を細い針の付いた50 milliliterガラスシリンジに2回通し、その後、溶解液を氷上で10分間インキュベートします。サンプルを液体窒素で凍結させ、-80 °Cで最大3週間保存します。凍結したプロトプラスト溶解液の入ったチューブを室温で融解させた後、チューブを氷上に保持します。

氷上に置いた6本の新しい2 mLラウンドボトムマイクロ遠心チューブに、oligo-d(T)磁気ビーズを1.8 mLずつ分注します。各チューブのビーズ懸濁液を600 µLの溶解結合バッファーで洗浄するため、ピペッティングで軽く混ぜ合わせ、ローテーターを用いてビーズを2分間緩やかに回転させます。ビーズは氷上に保持してください。

次に、ビーズを含む6本のチューブすべてをマグネットラックに置き、完全に磁気回収されるまで少なくとも3分間待ちます。ビーズが完全に回収されると、懸濁液は透明になります。その後、6本すべてのチューブから上清を捨て、直ちにプロトプラスト溶解液 9 mLを分注します。

ピペッティングにより、懸濁液が褐色で均一になるまでビーズとライセートを混合します。チューブを4 °Cで1時間、緩やかに回転させながらインキュベートします。インキュベーション後、チューブを再びマグネットラックに3分間置きます。

すべてのビーズがチューブの側面に回収されたら、プロトプラスト溶解液を含む上清を6本の新しい2 mLラウンドボトムマイクロ遠心チューブに回収します。次に、ビーズが入った各チューブに氷冷した1.5 mLの洗浄バッファー1を加え、ピペッティングによりビーズを再懸濁させます。1分間緩やかに回転させた後、チューブを再びマグネットラックに3分間置きます。

上清を捨て、この洗浄ステップをもう一度繰り返します。氷冷した洗浄バッファー2を1.5 milliliters使用し、同様の洗浄手順を2回繰り返します。プロトプラスト溶解液からmRNPが効率的に単離されていれば、CLサンプルのビーズペレットの周囲にハローが観察されるはずです。

最後に、氷冷した低塩バッファー1.5 millilitersで洗浄手順をもう一度繰り返します。洗浄後、各チューブに溶出バッファー500 microlitersを加え、ピペッティングによってビーズを穏やかに再懸濁させます。50 degrees celsiusで3分間インキュベートし、poly-A tailed RNAを溶出させます。

ピペッティングを1回行い、ビーズを穏やかに再懸濁させ、チューブを磁気ラックに戻して4 °Cで5分間静置します。全6本のチューブから溶出液を回収し、氷上に置いた15 mLコニカルチューブにまとめます。これにより、約3 mmの溶出液が得られます。

RNAの質と量は、分光光度計を用いて直ちに測定できます。再利用するoligo-d(T)ビーズは、氷冷した溶出バッファー1 mLで2回洗浄して準備します。その後、氷冷したライシス結合バッファー1 mLで洗浄し、塩濃度を500 mMに戻します。

洗浄済みのoligo-d(T)ビーズを用いて、結合、洗浄、および溶出の手順をさらに2ラウンド繰り返します。これにより、プロトプラスト溶解液からpoly-Aテールを持つRNAが除去され、各サンプルにつき合計9 mLの溶出液が得られます。ビーズは保存し、最大3回まで別の実験に使用することが可能です。

RNAの品質を試験するため、テキストプロトコルに従って、UV架橋されたタンパク質をプロテイナーゼK溶液で消化します。次に、RNA精製キットを用いてRNAを精製し、残留した不純物を除去します。精製後、サンプルはqRT-PCRを用いたRNA品質試験に使用可能な状態になります。

まず、各サンプルの 8 mL に、RNAse A および RNAse T1 を含む 100 units の RNAse カクテルを加えて処理します。短時間ボルテックスした後、サンプルを 37 °C で 1 時間インキュベートします。mRNA 結合タンパク質（mRBP）を濃縮するため、遠心ろ過ユニットを用いてサンプルをろ過します。これにより、各サンプルから 2 µg のタンパク質を含む 75 µL が得られます。

長期保存する場合は、サンプルを-80°Cで冷凍してください。SDS-PAGEを実施するには、各濃縮サンプル25 µLに2Xローディングダイ15 µLを混合し、サンプルを95°Cで5分間加熱します。5%のスタッキングゲルと12%のセパレーションゲルを用いたSDS-PAGEゲルに、サンプルとタンパク質マーカーをロードしてください。

次に、超純水を用いてゲルを2回洗浄します（1回につき5分間）。市販の銀染色キットを用いてゲルを染色します。十分な数の開始プロトプラストを使用していれば、5分以内にタンパク質のバンドが現れます。

mRBPをさらに検証するため、テキストプロトコルに従って2枚目の1Dページゲルからペプチドを精製します。これらの精製されたペプチドは、ナノ逆相液体クロマトグラフィー、質量分析、および定性的・定量的プロテオミクスによって解析することが可能です。oligo-d(T)ビーズによるキャプチャ後、qRT-PCRにより、18S rRNAと比較してpoly ubiquitin 10リファレンスmRNAのレベルが有意に高いことが示されました。

oligo-d(T)ビーズはpoly-Aテールを持つRNAにのみ結合するため、溶出液にはmRNAが濃縮されていることが示唆されます。oligo-d(T)ビーズによるmRBPのキャプチャは、銀染色SDS-PAGEゲルを用いてさらに評価します。ゲルでは、非架橋のnon-CLサンプルと比較して、UV架橋したCLサンプルにおいてタンパク質量が有意に高いことが示されています。

UV照射時間は架橋効率に影響を与える可能性があります。この銀染色SDS-PAGEゲルにより、1分または3分のUV照射が最も強いバンド強度を示し、最適条件であることが確認されました。定量プロテオミクス解析により、合計325個のタンパク質が同定されました。

これらのタンパク質のうち225種類は、各タンパク質に存在するペプチドの量が少なく、ペプチド強度の変動が大きかったため、有意水準を下回っていました。しかし、これらすべてが定性的にCLサンプルのみで検出されたため、すべて陽性結果とみなしました。これら325種類のタンパク質は、さらにリボソームタンパク質、主要なRBP、および候補RBPの3つのカテゴリーに分類されました。

候補となるRBPは従来のRNA結合ドメインを欠いており、その役割のほとんどが検証されていないため、RNA調節における新たな機能を持つ可能性が示唆されています。この手法を習得すれば、適切に実施することで1週間で完了させることができます。本手法の開発後、植物の分子調節経路分野の研究者は、双子葉植物および単子葉植物の細胞や組織におけるゲノムワイドなメッセンジャーRNA結合プロテオームの探索が可能となりました。